169712. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers urogastron három komponensre történő frakcionálására

169712 3 4 A 7-komponens az alábbi fizikai tulajdonságokkal rendelkezik: Papírkromatográfia: n-butanol-ecetsav-piridinvíz 30:6:24:20 arányú elegy ében: egyetlen folt Rf

= 0,63; papírelektroforézis piridin-acetátban pH = 6,5 értéknél: kis ovális terület, mely enyhén az anód irányában halad; papírelektroforézis ecetsav-hangyasav elegyben pH = 2,1 értéknél: „csóva" mely.C-DNP lizinhez viszonyítva 1,57 frontális mobilitással halad; akrilamid-gélelektroforézis 0,1 mólos trisz-sósav pufferben pH = 8,9 értéknél: egyetlen folt, mely bróm-fenolkékhez viszonyítva 0,65 mobilitással az anód felé halad; izoelektromos pont pH =4,3; aminosav-arány elemzés alapján: Asp 7, Ser 3, Glu 5, Pro 1, Gly 4, Ala 2, Val 3, Cys 6, Met 1, lie 2, Leu 5, Tyr 5, Hisz 2, Lys 2, Trp 2, és Arg 2; fajlagos aktivitás (későbbi definíció szerint) = 0,2-0,5 M/kg. A nyers urogastron 3 komponensre történő frakcionálása során a fent hivatkozott Amer. J. Dig. Dis. közleményben leírtakhoz hasonló módszereket alkalmazunk, a végső eljáráslépések során azonban a végtermék kitermelése és tisztasága tekintetében jelentős haladást érünk el a korábban leírt preparatív elektroforézishez viszonyítva. Az urogastron készítmény tisztaságát kromatográfiás módszerekkel igen nehéz meghatározni (kivéve ha nagymértékben tisztított készítményről van szó) és ezért a fajlagos biológiai aktivitást tekintik a tisztaság legfontosabb mértékének. A leírásban fajlagos biológiai aktivitáson a készítmény /ti/kg dimenzióban kifejezett azon mennyiségét értjük, mely Heidenhain tasakkal ellátott kutyának - melynek gyomorsav kiválasztását hisztamin infúzióval a kiválasztás maximális értékének 60— 80%rára emeljük — intravénás injekció formájában beadva, a savkiválasztás 50-70%-os gátlását idézi elő [Gregory R. A.: J. Physiol. 29,528-546 (1955)]. Különböző kutyákon mérve ugyanazon minta fajlagos aktivitása bizonyos mértékben változhat és ezért különböző minták fajlagos aktivitásának pontos összehasonlításához ugyanazt a kutyát kell használni. Találmányunk tárgya ennek megfelelően eljárás nyers urogastron három komponensre történő frakcionálására azzal jellemezve, hogy (1)5-10 nlkg fajlagos aktivitású urogastron készítményt 4,5 pH-jú 0,01 mólos vizes pufferrel egyensúlyba hozott karboxi-metil-cellulóz-oszlopra viszünk fel, az oszlopot 5,0 pH-értékű pufferrel 0,01—0,5 mól koncentrációgradiens szerint eluáljuk és a biológiai aktivistást mutató eluált anyagokat egyesítjük és liofilizáljuk; (2) az (1) lépés szerint nyert biológiailag aktív anyagot porózus poliakrilamid-gél oszlopra visszük fel — mely gél az 5000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat nem engedi át, azonban az 5000-nél kisebb molekulasúlyú molekulákat belsejébe beengedi - 0,05 mólos, 7,2 pH-jú, illékony komponensekből álló vizes pufferoldatban, az oszlopot ugyanezzel az oldattal eluáljuk és a biológiai aktivitást mutató eluált anyagokat egyesítjük és liofilizáljuk; (3) a (2) lépés szerint nyert biológiailag aktív anyagot 0,01 mólos, pH = 5,5 értékű, illékony komponensekből álló vizes pufferrel egyensúlyba hozott aminoetil-cellulóz-oszlopra felvisszük, az oszlopot előbb a fenti molaritású, majd 0,01-0,3 mól koncentráció gradiensű pufferrel eluáljuk, az oszlopról nyert egyes frakciók biológiai meghatározásával 5 biológiailag aktív eluált anyagra utaló három csúcs jelenlétét mutatjuk ki és az a-urogastront, 0-urogastront illetve 7-urogastront tartalmazó frakciókat külön egyesítjük és liofilizáljuk, majd — a (3) lépésnél kapott, j3-urogastron tartalmú 10 anyag esetében — az anyagot 0,01 mólos, 5,0 pH-értékű vizes pufferrel egyensúlyba hozott karboximetil-cellulóz-oszlopra visszük fel, az oszlopot 5,0 pH-értékű 0,01—0,5 mól koncentrációgradiensű pufferrel eluáljuk, a biológiai aktivitást mutató eluált 15 anyagokat egyesítjük és liofilizáljuk, ezt az anyagot porózus poliakrilamid gélből álló oszlopra — mely gél az 5000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat nem engedi át, azonban az 5000-nél kisebb molekulasúlyú molekulákat belsejébe beengedi - visszük fel 0,05 20 mólos, 7,2 pH-értékű, illékony komponensekből álló vizes pufferben, az oszlopot a fenti oldattal eluáljuk és a biológiai aktivitást mutató eluált anyagokat egyesítjük és liofilizáljuk; vagy a (3) lépésnél kapott, a 7-urogastron tartalmú anyag esetében ezt az anyagot 25 0,01 mólos, 4,8 pH-értékű vizes pufferrel egyensúlyba hozott karboxi-metil-cellulóz-oszlopra visszük fel, az oszlopot 4,8 pH-értékű, 0,01—0,5 mól koncentrációgradiensű pufferrel eluáljuk, a biológiai aktivitást mutató eluált anyagot egyesítjük és liofilizáljuk, ezt 30 az anyagot porózus poliakrilamid-gél oszlopra — mely gél az 5000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat nem engedi át, azonban az 5000-nél kisebb molekulasúlyú molekulákat belsejébe beengedi — visszük fel 0,05 mólos, 7,2 pH-értékű, illékony komponensekből 35 álló vizes pufferben, az oszlopot a fenti oldattal eluáljuk és a biológiai aktivitást mutató anyagokat egyesítjük és liofilizáljuk. Az „illékony komponensekből álló" kifejezésen azt értjük, hogy a magas vákuumban fagyasztva 40 szárított pufferoldat teljesen illékony. A puffer általában ammóniának vagy valamely aminnak gyenge szerves savakkal képezett sói keverékéből áll (pl. ammónium-acetát vagy ammónium-acetát-ecetsav, elegy). 45 A karboxi-metil-cellulóz-oszlopok kromatografálására felhasznált pufferoldat előnyösen nátriumacetát és ecetsav elegyéből áll. Az amino-etil-cellulóz kromatografálására felhasznált pufferoldat előnyösen ammónium-acetát és ecetsav elegyből áll. A porózus 50 poliakrilamid-gélen — mely gél az 5000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat nem engedi át, azonban az 5000-nél kisebb molekulasúlyú molekulákat belsejébe beengedi — előnyösen ammónium-acetát oldatot alkalmazunk. 55 A fenti oszlopok eluálásakor kapott eluátumokban az anyag jelenlétét előnyösen oly módon határozhatjuk meg, hogy megmérjük a 280 m/x hullámhosszú ultraibolya fény abszorpcióját; a fentiek szerint hatóanyagot tartalmazó frakciók biológiai aktivitását a 60 fentiek szerint határozzuk meg. Az anyagot előnyösen az eluátum megfelelő frakcióinak liofüizálásával gyűjthetjük össze. A kiindulási anyagot a, korábbiakban hivatkozott Amer. J. Dig. Dis közleményben leírtak szerint 65 állíthatjuk elő. 2