169641. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy fajlagos aktivítású nyers sztreptokináz elkülönítésére
3 169641 4 pH = 8,0 értéken oldhatjuk le. Az eluátumból önmagában ismert módon, kalciumklorid hozzáadásával, kalciumfoszfátja formájában eltávolíthatjuk a sztreptolizint, és ezzel egyidejűleg a szennyezőanyagok legnagyobb részét is leválaszthatjuk. Ezután a terméket 5 ismert módon etanollal vagy ammóniumszulfáttal kicsapjuk, majd vízzel szemben végzett dializálással és liofilizálással különítjük el. Körülbelül 30 000 Christensen-egység/mg fehérje faktorú, sztreptolizintől mentes nyers sztreptokinázt kapunk. 10 A Streptococcusok tenyésztésére táptalajként glükóz-, só- és vitamin-adalékot tartalmazó, tripszines kazein-peptont használhatunk. Egyéb táptalajok alkalmazásakor a hozam csökken. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként 15 szűrés és 3-hoz közeli pH-értékre való beállítás után felhasználhatjuk például a 923 453 és 924 562 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásokban ismertetett eljárásokkal kapott fermentleveket, különösen az utóbb említett szabadalmi leírásban ismer- 20 tetett ß-hemolizalo hatású Streptococcusok közül az úgynevezett Lancefield A, valamint Human C és G csoportba tartozó mikroorganizmusok tenyésztése útján kapott fermentleveket. Kiindulási anyagként felhasználhatjuk továbbá a Streptococcus equisimilis 25 [deponálva a Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie (69 Jena, Beuthenbergstr. 11, Német Demokratikus Köztársaság) törzsgyűjteményben IMET B 377 szám alatt] tenyésztése útján kapott fermentleveket is. 30 A találmány szerinti eljárás előnye, hogy nem igényel költséges adalékanyagokat, gyakorlati kivitelezése egyszerű, a beadagolt karboximetil-cellulóz regenerálható, a sztreptokináz 60—90%-os hozammal különíthető el, továbbá gyakorlatilag steril, és így minden további 35 kezelés nélkül szennyvízként elvezethető extrahált szűrt fermentlevet szolgáltat. Rendkívül előnyös, hogy a sztreptokináz ioncserés megkötése során meghatározott extrakciós körülmények között a szennyezőanyagok főtömegét minden további műveleti lépés nélkül 40 eltávolíthatjuk. A találmányt az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példában ismertetjük. pH-ját 9,0-ra állítjuk, szulfátmentességig dializáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ezzel az eljárással 2,5 X 104 Christensen-egység/mg faktorú sztreptokinázt kapunk, amely a kiindulási aktivitás 80%-ának felel meg. Gyógyászati célokra a kapott terméket ismert módon tovább tisztíthatjuk. A példában használt szűrt fermentlevet az alábbiakban ismertetett módon állítjuk elő. 1. és 2. előtenyésztési szakasz Tápoldatot készítünk húsból vagy halból nyert 20 g/l pankreásszal kezelt peptonból, 5 g/l nátriumkloridból és 2% marhaszérumból vagy élesztőautolizátumból (az élesztőautolizátum a tápoldatra vonatkoztatva 0,2% nitrogént tartalmaz). A tápoldatot 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltjük, sterilizáljuk, és fiziológiás konyhasóoldattal készített 10 ml Streptococcus equisimilis (deponálva a Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, 69 Jena, Beuthenbergstr. 11, Német Demokratikus Köztársaság, törzsgyűjteményben IMET B 377 szám alatt) szuszpenzióval beoltjuk. 16 órán át 37 °C-on történő tenyésztést követően az 1. előtenyeszetből 20—20 ml-t 2000 ml tápközeget (2. előtenyészet) tartalmazó keverőedényekbe átoltunk, vagy mint inokulumot a főtenyészethez használjuk fel. A 2. előtenyészet a tápoldat súlyára vonatkoztatva 0,2% nitrogént tartalmazó élesztőautolizátumot, valamint a szokásos sókat (KH2P0 4 , K 2 HP0 4 , CH 3 COONa, Na2 HC0 3 , MgS0 4 , FeS0 4 . (NH 4/2 S0 4 , MnCl 2 ) tartalmazza. A tenyésztést legkorábban a logaritmikus növekedési fázis kezdetéig, legkésőbb a végéig, azonban célszerűen a közepéig (közel 18 óra) 28 °C-on végezzük. Amennyiben 37 °C-on dolgozunk, a tenyésztés időtartama csupán közel 7 óra. A 2. előtenyészet előnyösen alkalmazható oltóanyagként a következő főtenyészethez, minthogy aktív szaporodási fázisában tartalmazza a Streptococcus equisimilis IMET B 377 mikroorganizmust, és így utóbbinak a további szaporodása azonnal megindul. Főtenyészet 45 Példa 10 g karboximetil-cellulózt 30 percig 500 ml, 0,2 n ecetsav-oldattal egyensúlyba hozunk, majd 500 ml 0,01 n ecetsav-oldattal mosunk. Az így előkészített 50 karboximetil-cellulózt 5 liter szűrt Streptpcoccus-fermentléhez adjuk, amelynek pH-ját előzetesen 3,0-ra állítjuk. 2 órás keverés után az elegyet G2 jelű durvapórusú zsugorított üvegszűrőn szűrjük, és a szűrletet elöntjük. A karboximetil-cellulózt ezután 0,5 liter 55 0,01 n ecetsav-oldattal mossuk. Végül a sztreptokinázt 1 liter 8,0 pH-értékű, 0,05 mól foszfátot és 0,1 mól nátriumkloridot tartalmazó foszfátpufferrel leoldjuk. Az eluátum pH-ját 7,0-ra állítjuk, és állandó pH-érték fenntartása közben a sztreptolizint 10 ml 1 mólos kai- 60 ciumklorid-oldat adagolásával kicsapjuk. 30 perc elteltével a csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A folyadékfázisból 5,5 pH-értéken 350 g/liter ammóniumszulfáttal kicsapjuk a sztreptokinázt. A kivált csapadékot körülbelül 60 ml vízben oldjuk, a szuszpenzió 65 A főtenyészethez használt tápoldat az alábbi összetételű : 15—120 g/l tápoldat mennyiségű élesztőautolizátum, ami a tápoldatban 0,1—0,8%, előnyösen 0,2—0,4% nitrogéntartalomnak felel meg, továbbá KH2 P0 4 K2 HP0 4 CH3 COONa.3H 2 0 (pro anal.) NaHCOj MgS04 .7H 2 0 FeS04 .(NH 4 ) 2 S0 4 MnCl2 .4H 2 0 glükóz 2,50 g/l tápoldat 2,50 g/l tápoldat 1,00 g/l tápoldat 1,00 g/l tápoldat 0,40 g/l tápoldat 0,02 g/l tápoldat 0,02 g/l tápoldat 10,00 g/l tápoldat A sóoldatot és az élesztőautolizátumot egységes oldat formájában vagy külön-külön sterilizálhatjuk. Az élesztőautolizátumot sterilre is szűrhetjük. Ezután a tápoldathoz sterilizált glükózoldatot adunk. A tápoldatot fermentorba töltjük, majd a tápoldat súlyára vonatkoztatva 1: 100 térfogatrész arányban az 2
