169436. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és analitikai reagens haptének kimutatására és meghatározására
169436 10 Az ösztradiol-HRP 50%-ának az antitesthez való kötődését megakadályozó ösztron (Ei), ösztradiol (E2 ) és ösztriol (E 3 ) koncentrációk ng/ml Antiszérum Nyúl A Nyúl B Hapten EÍ Ei szukcinil (technika állása) 4 Maleinil (találmány szerinti) 3 Glutaril (találmány szerinti) 4 Oxim (találmány szerinti) 2 6 190 12 9 300 4 160 3 3 100 5 150 8 6 300 2 150 1 0.8 50 3. példa Progeszteron meghatározása A) 11 a-OH-progeszteron-11 -szukcinil-bázikus foszfatáz (AP) és 12a-OH-progeszteron-12--szukcinil-AP meghatározása / Az említett anyagokat az ösztrogén-származékokhoz hasonlóan az l.A) példa szerinti módon állítottuk elő, azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként 55 mg progeszteron-hemiszukcinátot és 125 mg AP-t használtunk. B) lla-OH-progeszteron-11-szukcinil-BSA és 12a-OH-progeszteron-l 2-szukcinil-BSA előállítása E vegyületeket az ösztrogén-származékokhoz hasonlóan az l.B) példa szerinti módon állítottuk elő. C) lla-OH-progeszteron-11-szukcinil-BSA és 12a-OH-progeszteron-12-szukcinil-BSA elleni antitestek előállítása Ezeket az antitesteket az 1 .C) példa szerinti módon állítottuk elő. D) Progeszteron meghatározása Az itt alkalmazott módszer lényegében nem különbözik az ösztradiol meghatározásával kapcso- 50 latban az l.D) példában leírt módszertől. Az enzim meghatározását az alábbiak szerint végeztük: 0,5 ml enzimtartalmú mintát hozzáadtunk 0,5 ml szubsztrát-oldathoz. (0,01 mól p-nitrofenilfoszfát 0,1 mólos, 2pH-jú karbonátpufferben, amely 55 B) MBSA-folát elleni antiszérumok készítése 0,007 mól magnéziumkloridöt tartalmaz). A keveréket 37 C -on inkubáltuk 30 percen át, azután az extinkciót 400 nm-nél mértük. geszteron-12-AP-t antiprogeszteron-11-BSA-val kombinálva tartalmazó rendszerek. 20 Az e példában leírt reakciókat 0,01 mólos 7,5 pH-jú 0,1% lakalbumint tartalmazó veronál-pufferben végeztük, eltekintve azoktól az esetekből, ahol mást említünk. 25 E) Progeszteron meghatározása 3.D) példában leírtakhoz hasonló eredményt értünk el az alábbi meghatározással: 30 0,5 ml progeszteron-oldatot 0,lml megfelelő hígítású" antiszérummal inkubáltuk 30 percen át, azután megfelelő hígítású progeszteron-AP 0,1 ml-ét adtuk a keverékhez, amelyet újból 30 perceri át inkubáltunk. Ezután 0,3 ml Norit szuszpenziót 35 (25 mg/ml) adtunk előzetes dextránnal való inkubálás és mosás után a keverékhez, azután a keveréket 15 percen át centrifugáltuk és meghatároztuk a felülúszó rész AP-aktivitását, a 3.D) példa szerinti módszerrel. 40 4. példa Fólsav meghatározása 45 A) MBSA-folát előállítása 25 mg l-ciklohexil-3-(2-morfolinoetil)-karbodiimidet és 20 mg fölsavat hozzáadtunk 50 mg metilezett szarvasmarha szérum-albuminhoz (MBS A) 5 ml 0,05 mólos 7,0 pH-jú foszfátpufferben. A reakcióelegy komponenseit két órán át reagáltattuk, azután desztillált vízzel szemben extenzíven dializáltuk, azután liofilizáltuk. Az eljárást az l.C) példa szerinti módszerrel hajtottuk végre. Azt találtuk, hogy az olyan meghatározási rend- 60 szerek, amelyekben progeszteron-11-AP volt kombinálva antiprogeszteron-11-BSA-val vagy progeszteron-12-AP antiprogeszteron-12-BSA-val, 4-10-szer kevésbé érzékenyek progeszteronra, mint a progeszteron-11-AP-t antiprogeszteron-12-BSA-val vagy pro- 65 C) Folát-glukózoxidáz (FGO) ésPteroil-glukózoxidáz (PGO) előállítása 1 mg fólsavat vagy 0,7 mg pteroilsavat feloldottunk 5 ml 0,05 mólos, 7 pH-jú foszfátpufferben, amely 0,5 mg l-ciklohexil-3-(2-morfolinoetil)-karbo-5
