169436. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és analitikai reagens haptének kimutatására és meghatározására

5 169436 6 vagyis oxálsavat, míg a másik esetben Y szénatomot, például négy szénatomot tartalmazó dikarbonsavat, vagyis borostyánkősavat használunk. Eltérő természetű kötéseket kaphatunk akkor is, ha kémiailag eltérő, de immunolőgiailag hasonló hapténeket használunk a haptén-enzim konjugát és a hapten és a nagymolekulájú vegyület összekapcsolásával készített kapcsolt termék előállításához. A kémiai eltérés fennáll már akkor is, ha a két hapten egy vagy több kettőskötésben különbözik, [ilyen például a tesztoszteron és a dihidrotesztoszteron] és/vagy egy vagy több szubsztituensben, így hidroxil-csoportban, oxo-csoportban, halogén-atomban, vagy alkil-csoportban mutatkozik különbség a haptének között, mint például az ösztradiol és a lla-hidroxi-ösztradiol között, vagy az egyik hapten a másiknak funkciós származéka, például acilátja vagy étere. Ilyen például a morfin és a kodein. Azt tapasztaltuk, hogy még érzékenyebb vizsgálati rendszert kaphatunk, ha mindkét kapcsolt termékben ugyanolyan típusú kötéseket alakítunk ki, amelyek azonban abban különböznek egymástól, hogy a haptén-molekulák eltérő helyein alakulnak ki. így például, ha ösztradiolt használunk hapténként, és az egyik esetben a 11-hidroxi-ösztradiol 11-szukciniloxi-származékán, a másik esetben 17-szukciniloxi-származékán alakítjuk ki a kötést. Az így előállított antitesteket a találmány szerint oly módon használjuk meghatározásra, hogy egy adott ideig reagáltatjuk a meghatározni kívánt haptén-mennyiséggel és egy adott mennyiségű haptén-enzim konjugáltai, azután a szabad haptén-enzim konjugátot elkülönítjük az antitesthez kötődött haptén-enzim konjugáttól. Az elválasztás számos különféle módszerrel történhet, így például az antitesthez kötődött haptén-enzim konjugátot kicsaphatjuk egy szerves oldószerrel vagy sóval a szabad haptén-enzim konjugátot dextrán-réteggel bevont aktív szénen szelektív adszorpciónak vethetjük alá, vagy az antitestekhez kötődött haptén-enzim konjugátot egy második, az első elleni antitesttel kicsaphatjuk. Ez utóbbi módszert kettős antitest módszernek nevezzük. Az elválasztást oly módon is végezhetjük, hogy a hapténnal szembeni antitesteket a hapténnal és a haptén-enzim konjugáttal reakcióba való bevitele előtt oldhatatlanná tesszük. Ekkor az elválasztást egyszerű centrifugálással megoldhatjuk. Ezt a módszert gyakran szilárd fázis módszernek nevezik. Az antitesteket keresztkötésekkel lehet oldhatatlanná tenni, így például glutáraldehiddel vagy egy klórhangyasav-alküészterrel, vagy oly módon, hogy egy oldhatatlan hordozóra, például cellulózra, agarózra, polisztirolra vagy más hasonló anyagra kötjük őket. A kettős antitest módszert és a szilárd fázis módszert kombinálni is lehet, ez az un. DASP módszer. Ekkor egy az első antitesttel szembeni második antitestet készítünk oly módon, hogy az első antiszérum vagy az ugyanabból az állatfajból származó normál szérum immunoglobulin frakcióját egy az első antiszérum fonásától eltérő állatfajba oltjuk, azután a második antiszérumot az első antitest oldhatatlanná tételére előbb ismertetett bármely módszerrel, például cellulóz részecskékre való lekötéssel oldhatatlanná tesszük. A találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez előnyösen az ugyancsak a találmány tárgyát képező S kompozíciót használjuk. Egy oldhatatlanná tett antitest felhasználásán alapuló meghatározási módszerhez való kompozíció az alábbi komponenseket tartalmazza: 10 1. meghatározott mennyiségű haptén-enzim konjugát, 2. meghatározott mennyiségű oldhatatlanná tett antitest. 15 Oldhatatlanná tett második antitest felhasználásán alapuló meghatározáshoz (DASP módszer) az alábbi összetételű kompozíciót használjuk: 1. adott mennyiségű haptén-enzim konjugát, 20 2. adott mennyiségű első antiszérum, 3. meghatározott mennyiségű oldhatatlanná tett második antiszérum. Ezen felül mindkét találmány szerinti kom-25 pozíció tartalmazhat további komponenseket, így például az enzim aktivitásának meghatározásához való reagenseket. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg 30 közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa 35 ösztrogének meghatározása A) ösztradiol-17-szukcinil-HRP és llo-ösztradiol-11-szukcinü-HRP előállítása 40 50 mg ösztradiol-17-hemiszukcinátot vagy 50 mg 11 a-hidroxi-ösztradiol-11 -hemiszukcinátot 2 ml di-O oxánban oldunk. Az oldatot 8 C -ra hűtjük le, azután 0,07 ml tri-n-butilamint és 0,015 ml izobutilklórkarbonátot adunk hozzá. 30 perc múlva 45 50 mg tormaperoxidáz (HRP) 7,5 ml 3 :2 víz-dioxán eleggyel (pH = 9) készített oldatát adjuk az oldathoz. A kapott reakcióelegyet 4 órán át reagáltatjuk, azután folyó csapvízzel szemben egy éjszakán át dializáljuk, azután Sephadex G-25-tel 50 töltött oszlopon desztillált vízzel tisztítjuk. Az enzim-tartalmú frakciókat liofilizáljuk. A konjugát további tisztítását sűrűség-gradiens centrifugálással végezzük. (20-60% szacharóz, 16 óra, 238 000 g). 55 B) ösztradiol-17-szukcinil-BSA és lla-ösztradiol-11-szukcinil-BSA előállítása Ezeket a konjugátokat hasonló módon állítjuk elő, mint a megfelelő HRP származékokat, azzal a 60 különbséggel, hogy kiindulási anyagként 50 mg ösztradiol-hemiszukcinátot és 150 mg szarvasmarha-szérum albumint (BSA) használunk. A keverékből háromszor választjuk le a csapadékot 4,5 pH-nál 1,5 térfogatrész acetonnal, a Sephadex G-25-tel 65 való tisztítás helyett. 3