169405. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(helyettesített)amino-3- (helyettesített)-piridazinil-tiometil -cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására

5 169405 6 nem lépnek kémiai reakcióba valamelyik kiindulási vegyülettel. Célszerűen alkalmazható oldószer a víz, aceton, tetrahidrofurán, dioxán, acetoriitril, kloroform, diklór-metán, diklór-etilén, piridin, dimetil-anilin, dimetil-szulfoxid stb. Bár a reakcióhőmérséklet gyakorlatilag esetleges, a reagáltatást rendszerint hűtés közben, vagy pedig szobahőmérsékleten végezzük. Valamely IV általános képletű vegyület és valamely V általános képletű vegyület reagáltatását végezhetjük az Escherichia, Bacillus, Proteus vagy Pseudomonas nemzetségekbe tartozó valamelyik baktériumtörzs tenyészetének vagy e tenyészet feldolgozása útján kapott anyagnak a jelenlétében. E célra a IV általános képletű vegyületeket szabad sav és só formájukon kívül használhatjuk a 2-fenil-2-hidroxi-ecetsavval alkotott származékaik formájában is, úgy mint az aminosav-származékokat, például az N-2-fenil-2-hidroxi-acetil-glicint, vagy továbbá inint a tioglikolsav-származékokat, amidokat és alkilészterekct. A reagáltatáshoz alkalmazható baktériumtörzsek közül megemlíthetjük az Escherichia coli (IFO-3542), Escherichia coli (ATCC-9637), Escherichia coli var. communior (IFO-3547), Escherichia coli var. communior (ÍFO-3548), Bacillus sp. (ATCC--14552), Proteus rettgeri (ATCC--9250). Escherichia coli (IFO-13502, FERM-P1718), Escherichia coli (IFO-3470, FERM-P-1720), Escherichia coli (IFO-3450, FERM-P-1719), Pseudomonas putida (IFO-3537, FERM-P-1717) és Bacillus sp. (IFO-12063, FERM-P-1716) törzseket. Az enzimes acilezési reakciót rendszerint úgy foganatosítjuk, hogy valamely IV általános képletű vegyületet és valamely V általános képletű vegyületet az alábbiakban (1) és (4) közötti számokkal jelölt anyagok valamelyikével érintkeztetjük, vagyis tulajdonképpen a fentiekben felsorolt baktériumtörzsek valamelyikét először tenyésztjük, majd az így kapott tenyészetet önmagában vagy alkalmas feldolgozás után a kiindulási vegyületekkel érintkeztetjük. Amennyiben a fentiekben említett baktériumok valamelyikének szintetizáló aktivitása intracelluláris (sejten belüli) és nem magát a tenyészetet, hanem a tenyészet feldolgozása útján kapott anyagot használjuk a fenti reakcióhoz, úgy ez az anyag lehet például (1) a tenyészetből elkülönített sejtek halmaza, (2) sejtmentes, a hatásos enzimet tartalmazó extraktum, amely előállítható a sejtekből ismert módon, (3) részben vagy tökéletesen megtisztított hatásos enzim, amely az előző pontban említett sejtmentes extraktumból ismert módon elkülöníthető, vagy (4) a hatásos enzim olyan változata, amelyet a részben vagy teljesen tisztított enzimnek egy, vízben nem oldódó makromolekuláris anyaghoz kémiai vagy fizikai úton végzett kötése útján állítottunk elő. Másrészt ha a fentiekben említett baktériumok valamelyikének szintetizáló aktivitása extracelluláris (sejten kívüli), akkor használhatjuk például (1) a tenyészetből a sejtek centrifugálás útján végzett eltávolításakor kapott felülúszó folyadékfázist, (2) a részben vagy teljesen tisztított enzimet, amely előállítható a felülúszó fázisból ismert módon, vagy (3) ennek az enzimnek olyan változatát, amelyet, a részben vagy teljesen tisztított enzimnek egy, vízben nem oldódó makromolekuláris anyaghoz kémiai vagy fizikai úton végzett kötése útján állítottunk elő. Ezekben az esetekben 5 a kondenzációs reakciót rendszerint célszerűen vizes közegben foganatosítjuk, és a vizes oldat pH-értékét előnyösen 4 és 8, különösen előnyösen 4,5 és 6,5 között tartjuk. Ha az alkalmazni kívánt tenyészet vagy e tenyészet feldolgozása útján ka-10 pott anyag vízoldható, abban az esetben a kondenzációs reakció az eredeti oldatban foganatosítható, ha viszont a tenyészet vagy a tenyészet feldolgozása útján kapott anyag vízben nem oldódik, akkor ezt a reakciót vagy szuszpenzióban, vagy alternatív 15 módon úgy foganatosítjuk, hogy egy oszlopot megtoltunk a vízben oldhatatlan enzim-származékkal, majd az oszlopon keresztül bocsátjuk egy V és egy IV általános képletű vegyület vizes oldatát úgy, - hogy a kondenzációs reakció végbemehessen aza-20 latt, míg az oldat az oszlopban lefelé halad. Ezekben az esetekben a reakcióelegyhez a kondenzáció hozamának növelésére valamilyen vízoldható szerves oldószert, például valamilyen alkoholt 25 vagy acetont adhatunk. Bár a reakcióidő olyan tényezőktől függ, mint a szubsztrát-vegyületek koncentrációja, a hatásos enzim aktivitása és a íeakcióelegy hőmérséklete, rendszerint 10 perc és 300 perc közötti nagyságú vagy hosszabb. A reakcióelegy 30 hőmérsékletét célszerűen 5 C és 50 C közé állítjuk be. A szubsztrát-vegyületek koncentrációját elsősorban a hatásos enzim aktivitása determinálja, de általában a IV általános képletű vegyületek koncentrációját a reakcióelegyeben 0,1 súly% és 35 20 súly9? közé állítjuk be. Az I általános képletű vegyületek jó hozammal való előállításához a IV általános képletű vegyületekre vonatkoztatva az V általános képletű vegyületeket legalább egy mólekvivalensnyi mennyiségben használjuk. 40 A fentiekben említett baktériumok valamelyikének tenyésztésére tenyésztési módszerként dolgozhatunk levegőztetett kevert tenyészettel, rázatott tenyészettel vagy nyugvó tenyészettel, bár 45 általában az aerób tenyésztés előnyös. A táptalaj tartalmazhat egy vagy több természetes tápanyagot, így például húskivonatot, élesztőkivonatot, peptont, kazaminosavat, kukoricalekvárt stb., továbbá tartalmazhat 0,05 - 0,5% mennyiségben fenil-ecetsavat 50 és megfelelő mennyiségekben szénhidrátokat, szerves savakat, különböző szénhidrogéneket, például normál paraffinokat, különböző szerves és szervetlen nitrogénvegyületeket (amelyek aminocsoport formájában, illetve nitrát formájában tartalmaznak 55 nitrogént), fémsókat, például foszfátokat, magnéziumsókat, nátrium-kloridot stb. és különböző vitaminokat. A táptalaj pH-értékét 6 és 9 közé állítjuk be a tenyésztés előtt. Bár a tenyésztési idő többek között az adott baktériumtörzstől és más tenyész-60 tési körülményektől, így a tenyésztéshez alkalmazott berendezéstől, a táptalaj összetételétől és a tenyésztési hőmérséklettől függ, célszerű, ha a tenyésztést felfüggesztjük, amikor a tenyészet enzimaktivitása csúcsot ér el. Ez a csúcs a baktériumnö-65 vekedés logaritmikus szakaszának második fele és a 3