169402. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cefem-karbonsav-származékok előállítására

11 169402 12 í. referenciapélda 200 ml térfogatú kúpos lombikokba bemérünk 20 ml B jelzésű táptalajt (Escherichia coli baktérium esetében) vagy C jelzésű táptalajt Esche- 5 richia coli (IFO—3542), Pseudumonas putida (IFO-3537), Bacillus sp. (IFO-3860) és Proteus rettgeri (ATCC-9250) 2 napos, ferde tenyészetéből egy oltókacsnyi mennyiségű anyaggal, és azt követően a tenyészeteket rázatás közben 24 órán át 10 24 C -on (Escherichia coli baktérium esetében) vagy 28 C -on inkubáljuk. A kapott tenyészeteket (kivéve a Bacillus sp. tenyészetét) centrifugáljuk, majd az így elkülönített sejteket 5 ml 0,2 mólos citrát-foszfát-pufferben (pH-ja 6,0) szuszpendáljuk. 15 A Bacillus sp. tenyészetét közvetlenül felhasználjuk az alábbi kísérletekben. Minden egyes sejtszuszpenzióhoz 10 mg/ml 7-ACA-t és 40 mg/ml TAG-ot tartalmazó vizes oldatból (pH-ja 6,0) 5 ml-t adunk, majd a kapott reakcióelegyet 4 órán át 37 C -on 20 tartjuk. A képződött cefalotin (CET) termék kvantitatív meghatározását spektrofotometriás módszerrel [Journal of the American Chemical Society, 94, 4035 (1972)] végezzük, amely módszerrel szelektíven mérni lehet a cefalosporinokat még 7-ACA 25 jelenlétében is a 260 mju-nál mérhető abszorpció csökkenésén át az • Aerobacter cloaseae (IFO-12937) által termelt 0-laktamázzal végzett kezelés után. A kapott eredményeket az alábbi I. táblázatban adjuk meg. 30 I. táblázat Mikroorganizmus A cephalothin hozama %-ban 35 40 Escherichia coü (IFO-3542) 46 Pseudomonas putida (IFO-3537) 41 Bacillus sp. (ATCC-14552) 37 Proteus rettgeri (ATCC-9250) 20 2. referenciapélda Escherichia coli (IFO-13502) ferde tenyésztés (28 C -on 24 órán át az A jelzésű táptalajon vég- 45 zett tenyésztés) útján kapott teljes tenyészetét 10 ml sterilizált vízben szuszpendáljuk, majd a kapott szuszpenzióval egy kétliteres lombikba töltött 400 ml B jelzésű táptalajt beoltunk. A beoltott táptalajt ezután rázatás közben 24 órán át 24C°-on inkubáljuk, majd a tenyészetet centrifugálva a sejteket elkülönítjük és 20 ml desztillált vízben szUszpendáljuk. Eközben 40 millimól cefalotint, és 0, 40, 120 vagy 280 millimól tienil-ecetsavat (a továbbiakban ezt a vegyületet „TA" rövidítéssel jelöljük) tartalmazó vizes oldatokat készítünk, egy-egy oldat térfogata 5 ml. Az egyes oldatokat ezután hozzáadjuk a sejtszuszpenzió 5-5 milliliterjéhez, majd a kapott elegyeket pH 6,0 értéken és 37 C°-on tartjuk a cefalotin hidrolízisének biztosítására. A reakcióelegy pH-értékét pontosan 6,0 értéken tartjuk egy pH-stabilizátor segítségével. Ha a reakció egyensúlyi állapotába kerül, a cefalotin és a 7-ACA koncentrációját spektrometriás és polarimetriás módszerekkel meghatározzuk. A kapott eredményeket, valamint az' egyensúly beállásához szükséges időt az alábbi II. táblázatban adjuk meg. Ugyanakkor meghatározzuk az egyensúlyi állapotot abban az esetben is, amikor a cefalotint 7-ACA-ból és TA-ból állítottuk' elő. Megállapítható, hogy az egyensúlyi állapotban a cefalotin mólaránya a 7-ACA és a TA alkalmazóit mólarányától függ és lényéében egyezik a cefalotinnak a 7—ACA-hoz viszonyított mólarányával a cefalotin hidrolízisével 'kapcsolatos kísérletben. Megjegyezzük, hogy a fenti összehasonlítás esetében a cefalotinre vonatkozó koncentrációértéket TA és 7—ACA ekvimoláris mennyiségekben végzett reagáltatása esetén kapjuk. Minthogy a 7-ACA-ból és TA-ból kiinduló szintézis esetén az egyensúlyi állapot beállásához hosszú időre van szükség, az alábbi táblázatban megadott adatok csak azokra az eredményekre vonatkoznak, amelyeket a cefalotin hidrolízisénél kaptunk. A II. táblázatból látható, hogy ha a cefalotint 20 millimól 7-ACA-ból és 160 millimól TA-ból állítjuk elő, akkor a cefalotin hozama mindössze 30%. Ha a reakcióelegyben a szubsztrátum-koncentráció nő, akkor a cefalotin képződési aránya az egyensúlyi pontnál bizonyos mértékben ugyan nö-, vekszik, de minthogy a 7-ACA oldékonysága kicsiny, jelentős növekedés még abban az esetben sem várható, ha a koncentrációt 50 millimólra vagy még annál is nagyobb értékre növeljük. II. táblázat Az egyenA TA és a CET A TA és a 7-ACA A CET és a 7--ACA koncentsúlyi állapot koncentrációja a reakció koncentrációja rációja az egyensúlyi eléréséhez kezdetekor millimólban millimólban állapotban millimólban szükséges idő órában TA CET TA 7-ACA CET 7-ACA 0 20 20 20 0,9 19,1 0,5 20 20 40 20 1,2 18,8 1 60 20 80 20 2,1 17,9 2 140 20 160 20 6,0 14,0 4