169326. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására aktivészteres módszerrel katalizátorok hozzáadása útján

5 169326 6 amino-csoportot egyidejűleg felszabadítjuk (Na-sóképzés) és a katalízishez szükséges I általános képletű 1-hidroxi-vegyületet képezzük. A V védőcsoportként a peptidkémiában szokásos N-védőcsoportok jönnek számításba [vö. Schröder-Lübke, The Peptides, New York és London 1965/66]. Előnyös aralkil-oxikarbonil - mint pl. benziloxikarbonfl- vagy terc-alkiloxikarbonilmint pl. terc-butiloxikarbonil - gyököket alkalmazunk. A szerin, treonin és tirozin OH-csoportját védeni nem szükséges. A hidroxil-csoport azonban alkalmas csoportokkal, mint pl. terc-butil- vagy benzil•csoporttal védhető. A cisztein- vagy cisztin-peptidek előállításánál a cisztein SH-funkciós csoportját a peptidkémiában SH-védőcsoportokkal kell védeni vagy a reakciót szimmetrikus vagy aszimmetrikus cisztin-peptidekkel végezzük, amelyek adott esetben cisztein-peptidekké redukálhatok. W szubsztituens a III általános képletű vegyület karboxil-csoportjában egy polimer hordozót is jelenthet, amely a karboxil-csoporttal észter- vagy amidkötéssel kapcsolódik. Megfelelő polimerként a következők jönnek számításba: 1-2% divinilbenzollal térhálósított polisztirol, térhálósított fenol-formaldehid kondenzációs termékek, térhálósított fenoléter-formaldehid kondenzációs termékek, kémiailag kötött polisztirollal bevont műanyag felületek, polibenzilgyanták vagy fenil-csoporttal helyettesített üveg-felületek. Megfelelő kapcsoló-csoportként pl. a következőket alkalmazhatjuk: halogénmetil-, halogénacetil- vagy aminobenzhidril-csoportok. A kondenzációt előnyösen oldószerekben mint pl. dimetilformamidban, dimetilacetamidban, tetrametilkarbamidban vagy foszforsav-trisz-dimetilamidban adott esetben kevés víz hozzáadása közben végezzük. A reakció hőmérséklete előnyösen 0-40 C között van, célszerűen szobahőmérsékleten dolgozunk. A feldolgozás egyszerűen végezhető, mivel az I általános képletű találmány szerinti N-hidroxi-vegyületek, mint az 1-hidroxi-benzo-triazol vagy a 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-kinazolin nátrium- vagy káliumhidrogénkarbonáttal vagy nátriumkarbonát oldattal teljesen kirázható. Más vegyületek mint pl. az l-hidroxi-2-piridon vagy a 3-hidroxi-4-metil-2,3--dihidro-tiazol-2-tion már vízben könnyen oldódnak és így különösen könnyen eltávolíthatók a rendszerből. A nehezen oldható peptid származékokról az N-hidroxi-vegyületek izopropanollal, alkohollal, metanollal, tetrahidrofuránnal vagy forró vízzel is extrahálhat ók. A reakciónál képződő fenoloknak hasonló oldhatósági tulajdonságuk van, mint az N-hidroxi-vegyületeknek és ezeket a gyakorlatban együttesen távolítják el. A további tisztítás szokásos módon történik, pl. alacsonyabb peptidekné! egy szerves és egy vizes fázis közötti megosztással, vagy alkalmas oldószerből történő oldással és kicsapással, átkristályosítással vagy kromatográfiával, pl. „Sephadex LH-20" (térhálósított, részben éterezett dextrán-gél) és egy szerves oldószer vagy egy szerves-vizes oldószer-keverék felhasználásával, adott esetben megosztási. kromatográfia segítségével csak részben elegyedő oldószer-komponensekben. • Nagyobb molekulasúlyú peptideknél vagy pro-5 teineknél előnyös lehet csak a védőcsoportok léhasítása után a tisztítást elvégezni pl. izoelektromos kicsapással, kristályosítással, ellenáramú megosztással, megosztási kromatográfiával, gélkromatográfiával vagy preparatív elektroforézissel. 10 A védőcsoportok lehasítása azok jellegétől függ és a ül általános képletű reakciótermékek, illetve ilyen vegyületeken alapuló peptidek stabilitását kell tekintetbe venni. A lehasítást a peptidkémiában 15 ismert módon (vö. Schröder-Löbke loc. cit.) végezzük. N-acil-peptid-aktív észtereknél az I általános képletű N-hidroxi-vegyületek hozzáadása nem növeli a racemszármazékok képződését, mint azt a Chem. 20 Ber. 103 788 (1970) oldalon ismertetett racemizálási kísérletek alapján a jelen leírás kísérleti részében (vö. 2. táblázat, kísérleti rész) kimutatjuk. Mind nitrofenil- mind triklórfenil esetében ebben a racemizálási kísérletben N-hidroxi-vegyületek hozzá-25 adásával vagy anélkül racemizálódás nem következik be. Másképp viselkedik ezzel szemben a pentaklórfenilészter, amelynél kb. 80%-ig racemizált tripeptid képződik. 1-hidroxi-benzotriazol hozzáadásával ez az erős racemizálódási fok 26%-kal 30 csökkenthető 54%-ra. 2-hidroxipiridin-nátriumsó hozzáadása esetén — mint már említettük - fordított hatás következik be, vagyis a racemizálódási fok még növekszik. Az I általános képletű, találmány szerinti 35 N-hidroxi-vegyületek hozzáadásával a sztérikus gátlás, - amely az aktivált észterekkel végbemenő néhány reakciót egyébként meghiúsít — kiküszöbölhető, így pl. Nps-izoleucin-aktívésztereknek H-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH-val történő reagáltatá-40 sánál. A Nps—Ile-OTcp reakciója H-Cys(Trt)-Ser-Ler-Leu-OH-val dimetilformamidban a reakció végbemeneteléig nem követhető. 5 hét eltelte után a kísérletet megszakítjuk, mivel a melléktermék és kiindulási anyagon kívül vékony-45 réteg-kromatográfiával több bomlási termék kimutatható. Ha ezzel szemben pl. 1-hidroxibenzotriazolt, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-kinazolint vagy l-hidroxi-2-piridont adagolunk, akkor a reakció már 15-20 óra leforgása alatt befejeződik (vö. 50 3. táblázat, kísérleti rész). Az említett N-hidroxi-vegyületek váratlanul erős katalitikus hatása szilárdtest-peptid-kondenzációs módszerben is hasznosítható. így pl. a J. Amer. Chem. Soc. 90 2953 (1966) oldalán ismertetett 55 cikk szerint N-védett aminosavból és egy poli-4--hidroxi-3-nitro-sztirolgyantából a megfelelő oldhatatlan észter előállítható, amely aztán az oldható amino-vegyülettel a megfelelő amiddá vagy pepiiddé alakítható át. A találmány szerinti N-hidroxi-60 -vegyületek felhasználásával a reakcióidők erősen megrövidülnek. Még az átalakított Merrifield-szilárdtest-módszernél - ahol gyakran N-védett aminosav aktívésztert, mint pl. nitrofenilésztert használnak — a találmány szerinti adalékok a hozamot növelik és 65 a reakcióidőt csökkentik. 3