169171. lajstromszámú szabadalom • Elljárás és reagens koleszetrin meghatározására
7 169171 8 4. példa Kolesztenon meghatározása 0,2 ml szérumhoz (vízzel 1 :10-re hígítva) hoz- s záadunk 0,05 ml 20%-os hidroxi-polietoxi-dodekán-oldatot és 0,15 E koleszterinoxidázt. 15 perc múlva hozzáadunk 1 mM (2,4-dinitro-fenil)-hidrazin 1 N sósavval készült oldatából 2,0 ml-t. További 30 perc múlva hozzáadunk 4,0 ml vizet és a 10 képződött hidrazont 405 nm-nél fotométerrel lemérjük. A kiértékelés kalibrációs görbe alapján történik, figyelembe véve a reagensek vakértékét. A mérést 546 nm-nél is elvégezhetjük lúg hozzáadása után. 15 Egy tipikus minta mérése 60 mg% szabad koleszterint és 154 mg% összkoleszterint ad (elszappanosítás alkoholos káliumhidroxiddal). A Liebermann-Burchard reakcióval végzett össze- 20 hasonlító meghatározás 170 mg% összkoleszterint mutat. Az észterezett koleszterin elszappanosításához (összkoleszterin mérése a szérumban) 1 ml szérumot, 1 ml 20%-os hidroxi-polietoxi-dodekán-oldatot 25 és 5 ml 0,5 N alkoholos káliumhidroxidot elegyítünk és az elegyet 30 percig 70C°-on tartjuk. Ezután az oldatot lehűlni hagyjuk, elkeverjük 10 ml 0,1 M magnézium-szulfát-oldattal és lecent»rifugáljuk. A felülúszó (13 ml) az összkoleszterint 30 szabad formában tartalmazza. Az észterezett koleszterin májészterázzal, illetve koleszterinészterázzal (gyártó: Beohringer Mannheim) történő elszappanosításánál a szérumot 35 30 percig inkubáljuk 37 C°-on, pH 6-8 között. 5. példa 40 0,2 ml szérumot hozzáadunk 0,4% hidroxi-polietoxi-dekánt tartalmazó 2,5 ml 7,5 pH-jú 0,5 M nátrium-foszfát-pufferhez. Az extinkciót (E^ 240 nm-nél alkalmas spektrofotométerrel leolvassuk és a reakciót 0,02 ml (1,5 E) koleszterinoxidázzal 45 elindítjuk. 2 perc múlva az extinkciót (E2 ) újra leolvassuk. A képződött kolesztenon és ezzel a koleszterin koncentrációja az 1. és 2. leolvasás különbségéből adódik, figyelembe véve a kolesztenon moláris extinkciókoefficiensét 240 nm-nél, ér- 50 teke 15,5 cm2 /jumól. Egy tipikus minta mérése 58 mg% szabad koleszterint és 163 mg% összkoleszterint ad (elszappanosítás után). 55 s Liebermann-Burchard reakcióval végzett összehasonlító meghatározás szerint az összekoleszterin-tartalom 173 mg%. . 60 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás koleszterin vizes oldatban, előnyösen szérumban levő szabad és/vagy kötött és/vagy teljes mennyiségének meghatározására, azzal jellemezve, 65 hogy a koleszterint vizes közegben koleszterinoxidázzal előnyösen Proactinomyces fermentációval előállított koleszterinoxidázzal inkubáljuk és önmagában ismert módon meghatározzuk az oxigénfogyasztást, vagy a képződött hidrogénperoxidvagy kolesztenon mennyiségét, mikoris adott esetben az inkubálás előtt vagy után elszappanosítási végzünk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az oxigénfogyasztást polarometrikusan mérjük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a képződött hidrogénperoxidot enzimatikus úton kereskedelmi katalázzal vagy kereskedelmi peroxidázzal határozzuk meg. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a képződött kolesztenont közvetlenül 240 nm-nél, vagy ketoreagenssel - mint (2,4-dinitro-fenil)-hidrazinnal - reagáltatva mérjük. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy egy elszappanosítás nélküli és egy alkoholos káliumhidroxiddal való elszappanosítás utáni mintából a szabad és összkoleszterint különválasztva határozzuk meg. 6. Az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy egy mintában először a szabad koleszterint határozzuk meg, majd koleszterinészterázt adunk hozzá és ezután a kötött koleszterint határozzuk meg. 7. Reagens az 1. igénypont szerinti koleszterin-meghatározási eljárás foganatosítására, azzal jellemezve, hogy koleszterinoxidázból és hidrogénperoxid vagy kolesztenon detektáló rendszerből és adott esetben a kötött koleszterint elszappanosító rendszerből áll, és kívánt esetben felületaktív anyagot tartalmaz. 8. A 7. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a hidrogénperoxid meghatározására szolgáló rendszer katalázból, egy beta-diketonból - így acetil-acetonból -, egy kis szénatomszámú alifás alkoholból -különösen metanolból - és pufferből áll. 9. A 7. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a hidrogénperoxid meghatározására szolgáló rendszer peroxidázból, egy kromogénből - előnyösen 2,2'-amino-benztiazolin-szulfonsavból - és pufferből áll. 10. A 7. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a kolesztenon meghatározására szolgáló rendszer egy ketocsoportokkal reagáló származékból, különösen (2,4-dinitro-fenil)-hidrazinból áll. 11. A 8. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy az 13-150 E koleszterinoxidázt, valamint 2 • 104 —5 • 10 s E katalázt, 0,05-0,2 nil acetil-acetont, és 2-10 ml metanolt tartalmaz 100 ml 5-7 pH-jú ammóniumion-tartalmú pufferben. 4
