169168. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penám-3-karbonsav előállítására vízoldható enzim-komplexek segítségével

9 169168 10 10. példa Az újrafelhasználásra vonatkozó vizsgálatok A 6. példában leirt eljárás szerint fikoll-penicillin-dezaciláz komplexet tartalmazó oldatból 4 ml-t (4.ml = 44,4mg protein) 6,3 g kálium-benzil-peniciliint tartalmazó vizes oldathoz adunk, majd az oldatot 37 C°-on keverjük. A reakcióelegy pH-értékét 0,1 n nátriumhidroxid állandó hozzáadásával 7,8-értéken tartjuk. A pH ellenőrzéséhez titrimétert alkalmazunk. A reakció 4 óra után befejeződik, azonban az elegyet még további 2 óra hosszat reagálni hagyjuk. A 0,1 n nátriumhidroxid felvétel azt bizonyítja, hogy a 6-APA hozama 96,2%. Az enzimet a kis molekulasúlyú anyagoktól ultraszűréssel különítjük el. Az ultraszűréshez olyan membránt alkalmazunk, amelynek szűrési határa 50 000 mólsúlynál van. Az ultraszűrő által kiszűrt enzimet desztillált vízzel mossuk, és az enzim-polimer elegyet ismételt ultraszűrésnek vetjük alá, mindaddig míg az oldat térfogata 150 ml-re csökken. A maradékot 6,3 g káliumbenzflpenicillint tartalmazó újabb oldat bontásához használjuk fel. A bontás 96,5%-os hozammal megy végbe. Az egész ciklust további 3 alkalommal megismételve azt tapasztaljuk, hogy a penám-3-karbonsav-származék bontása 92,0%, 96,0%, majd 91,0%-os hozammal végezhető el. 11. példa 18,5 ml fikoll-penicillin-dezaciláz komplexet 400 ml-re egészítünk ki, majd 37 C°-on 7,8 pH-n keverjük. Az oldathoz 25 g kálium-benzil-penicillint adunk, és a pH-értékét 10 mól ammóniumhidroxid-oldat folyamatos adagolásával 7,8 értéken tartjuk. A reakciót 4 óra hosszat folytatjuk. Az enzimet a kis-molekulasúlyú anyagoktól dialízis segítségével különítjük el, a dialízishez DC2 dializátort, (Amicon Corporation, Lexington, USA) alkalmazunk. A betét molekulaszűrő szűrési határa 50 000-nél van. Ezt követően az enzim-oldatot mintegy 100 ml-re töményítjük be. A dializátort kétszer 100-100 ml desztillált vízzel mossuk, a mosóvizet az enzim-oldattal egyesítjük és 4 C°-on tároljuk. Hét egymást követő kísérletet végezve azt tapasztaltuk, hogy a kálium-benzil-penicillin hidrolízise 93,2%-os hozammal valósítható meg. Az enzim hasznosításának foka 99,6%. Az enzimveszteség kísérletenként 2,5% volt. Az egyes kísérletek előtt az enzimveszteséget pótoljuk. 12. példa Ali. példa szerint járunk el, és fikoll-penicillin-dezaciláz komplexet használunk fel a kálium-benzil-penicillin enzimatikus hidrolíziséhez. A reakciót 37,0 C°-on, 7,8 pH-értéken 4 óra hosszat végezzük. Az enzimet a kis-molekulasúlyú anyagoktól az alábbi módon választjuk el. A reakcióelegy térfogatát ultraszűréssel mintegy 40 ml-re csökkentjük. Az ultraszűréshez 50 000-es szűréshatárú membránt alkalmazunk. A betöményített oldathoz 20 ml desztillált vizet adunk, majd a töményítési folyamatot megismételjük. Az oldatokat egyesítjük és a térfogatot 120 ml-re csökkentjük. A betöményítéshez 5 rotációs bepárlót alkalmazunk, a bepárlás hőmérséklete 35 C°. Az oldat térfogatával azonos mennyiségű metil-izobutilketont adunk az elegyhez, majd hűtés közben az oldatot erélyesen keverjük. Amikor a hőmérséklet 4C°-ra csökken, az oldathoz lassan 10 salétromsavat adunk mindaddig, amíg a pH 4,3 nem lesz. A keverést további 30 percig folytatjuk. A csapadékként kivált 6-APA-t szűréssel elkülönítjük, metil-izobutilketonnal, vízzel és acetonnal mossuk, majd egy éjszakán át 37 C°-on szárítjuk. 13. példa Ali. példa szerint végezzük el a kálium-benzil-20 -penicillin enzimatikus hidrolízisét, azonban a művelethez 9%-os penicillin-oldatot használunk fel. 27 g kálium-benzil-penicillint 300 ml vízben oldunk, majd a 1 l-es példában leírt enzimkoncentráció kétszeresét alkalmazzuk. A reakciót 37 C°-on, 7,8 pH-értéken 25 4 óra hosszat végezzük. A hidrolízis 93,2%-os hozammal megy végbe. Szabadalmi igénypontok: 30 1. Eljárás 6-amino-penám-3-karbonsav előállítására vizes oldatban, 6,0 — 9,0 pH-értéken, benzil-karbonilamino-penám-3-karbonsavat vagy fenoximetil-karbonilamino-penám-3-karbonsavat vagy e vegyületek 35 sóit penicillin-dezaciláz enzim polimer komplexével reagáltatva, azzal jellemezve, hogy a penám-3-karbonsav bontását vízoldható polimer anyaggal képzett vízoldható enzim-komplexszel végezzük, majd az enzim-komplexet a reakcióelegyből ultraszűréssel 40 elkülönítjük, és a kapott 6-amino-penám-3-karbonsavat kinyerjük. (Elsőbbsége: 1972. november 21.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vízoldható enzim-komplexként maleinsavanhidrid polimerből, célsze-45 rűen maleinsavanhidrid és metilvinil éter kopolimerből és penicillinacilázból készült enzim-komplexet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1972. november 21.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vízoldható enzim-50 -komplexként módosított poliszacharidból, célszerűen szacharóz-epiklórhidrin kopolimerből készült enzim-komplexet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1973. szeptember 22.) 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás 55 foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a műveletet folyamatosan végezzük és az ultraszűréssel elkülönített enzim-komplex oldatot a reakciótérbe visszavezetjük. (Elsőbbsége; 1972. november 21.) 5. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási 60 módja, azzal jellemezve, hogy az ultraszűrőn áthaladt oldatot egy második reakciótérbe vezetjük, majd ismételt ultraszűrésnek vetjük alá, a szűrő által kiszűrt oldatot a reakciótérbe visszavezetjük, majd a kapott oldatból a 6-amino-penám-3-karbonsavat kinyerjük. 65 (Elsőbbsége: 1972. november 21.) 5