169168. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penám-3-karbonsav előállítására vízoldható enzim-komplexek segítségével

3 169168 4 nagyobb koncentrációban állítsunk elő. Ennek következtében a találmány szerinti megoldás elősegíti a 6-amino-penám-3-karbonsav gazdaságos előállítását, továbbá lehetővé teszi, hogy a műveletet a homogén . vizes fázisban folyamatosan végezzük. 5 A találmány szerinti eljárás feladata a 6-amino-penám-3-karbonsav előállítása. Az eljárás során 6,0 - 9,0 pH-jú vizes oldatban benzilpenicillint vagy fenoximetilpenicillint vagy ezek sóját vízoldható enzim-komplexszel kezeljük. Az eljárást oly módon 10 végezzük, hogy a penám-3-karbonsav-oldat bontását vízoldható polimer anyaggal képzett vízoldható enzim-komplexszel végezzük, majd az enzim-komplexet a reakcióelegyből ultraszűréssel elkülönítjük, és a kapott 6-amino-penám-3-karbonsavat kinyerjük. 15 A fentiekben leírt megoldás és enzim-komplexek újak. A találmány tárgyát képezi továbbá vízoldható enzimkészítmények előállítása, amelyekben a penicillin-dezaciláz enzim egy vízoldható közömbös polimer anyaghoz kötődik. 20 A dezaciláz enzimet, amennyiben benzilpenicillin hasításához kívánjuk felhasználni, célszerűen baktériumból, mint például Escherichia coli-ból állítjuk elő. Amennyiben a fenoxi-metilpenicillin megbontását kívánjuk elvégezni, az enzimet egy gombából 25 vagy Actinomycetes-ből állítjuk elő. Ezek az enzimek általában jól ismertek. Az enzimeket a 6-amino-penám-3-karbonsav előállításához 6,0 — 9,0, célszerűen 7,0 - 8,5 pH-jú oldatban alkalmazzuk. A penám-3--karbonsav dezacilezése során a penám-3-karbonsav 30 oldalláncáról egy szabad sav szabadul fel, ezért a 6-amino-penám-3-karbonsav előállítása során célszerű a fenti pH-értéket megfelelő lúgmennyiség hozzáadásával például nátrium vagy ammóniumhidroxid vagy trietilamin hozzáadásával biztosítani. A vízold- 35 ható enzim-komplexek előállításához sokféle vízoldható polimer anyagot használtunk fel. A megfelelő polimert kísérletes úton választjuk ki. Különösen alkalmasnak mutatkozott a maleinsavanhidrid vízoldható kopolimerje. Az eljáráshoz a 40 maleinsavanhidrid vagy akrilsavanhidrid vinilmetiléterrel, etilénnel, stirollal és/vagy vinilacetáttal készült vízoldható kopolimerjeit használhatjuk fel. Különösen eredményesen alkalmazható a metilviniléter/maleinsavanhidrid kopolimer (amelyet GANT- 45 REZ AN, közelebbről GANTREZ AN 149 néven hoznak forgalomba, G. A. F. Corporation, Nagy-Britannia, a kopolimer molekulasúlya 750 000, vagy a GANTREZ AN 169 kopolimer, amelynek molekulasúlya 1 125 000). A maleinsavanhidrid kopolimert a 50 penicillin-dezaciláz enzimmel az ismert megoldáshoz hasonlóan reagáltatjuk. Az ismert megoldást az 1 945 680-as számú Német Szövetségi Köztársaság-beli közzétételi irat ismerteti. Az enzimet puffer-oldat jelenlétében reagáltat- 55 hatjuk a GANTREZ AN polimerrel, de a semleges pH-t más módon is biztosíthatjuk. Vízoldható polimerként célszerűen poliszacharidokat alkalmazhatunk. Poliszacharidként használhatunk dextránt, dextrint vagy cellulózt, feltéve ha vízold- 60 ható, és vízoldható enzim-komplexet kapunk a penicillin-dezaciláz enzimmel való reakció során. A poliszacharidot megfelelően aktiválva végezzük el a reakciót. Az aktiváláshoz epiklórhidrint, vagy halogéncianidot használunk, vagy a poliszacharidot 65 előzőleg karboximetil-, hidroxietil-, vagy aminoetil-csoportokkal látjuk el. Azt találtuk továbbá, hogy különösen alkalmasak a találmány szerinti eljáráshoz a módosított szacharidok vagy oligoszacharidok, így a szacharóz, dextróz, vagy laktóz. A kereskedelmi forgalomban kapható FICOLL, amely egy cukor-epiklórhidrin-kopolimer, különösen kedvező. A fikoll molekulasúlya 400 000 körül van, ami igen kedvező. Fikollt alkalmazva vízoldható penicillin-dezaciláz-enzimet kapunk, amely a 6-amino-penám-3-karbonsav előállítása során kedvező hatékonyságot mutat. Nagyjelentőségű az, hogy ezek az enzim-komplexek alacsony viszkozitással rendelkeznek, ami lehetővé teszi, hogy az enzim-komplexet ultraszűréssel a reakcióelegyből könnyen elkülönítsük. Ily módon az elkülönített készítményt ismét felhasználhatjuk. A találmány szerinti vízoldható enzim-komplex előállításánál ismert módon egy enzimet a polimerhez kötünk, a művelet eredményeként vízoldható komplexet kapunk. A vízoldható kifejezés azt jelenti, hogy az enzim-komplex vízben oldható vagy diszpergálható, aminek következtében 7,8 pH-értéknél valódi vagy kolloid oldatot kapunk legalább 0,1 g/liter koncentrációban. A dezaciláz-enzimet a polimerhez oly módon köthetjük, hogy reagensként halogéncianidot, célszerűen brómcianidot, s-triazint, célszerűen 2-amino-4,6-diklór-s-triazint, azidokat, például 2-hidroxi-3--(p-diazofenü)-propilétert, szerves ciánokat, mint fenilcianátot, vagy di-karbonsavdiimideket alkalmazunk. Gyakran ezeket a reagenseket kötjük először a polimerhez, majd a reakcióképes csoportokkal rendelkező polimert az enzimmel reagáltatjuk. Más esetben az enzimet közvetlenül a polimerrel reagáltatjuk, különösen ha a polimer néhány aktív csoportot, mint anhidrid kötést, aminoetil-, hidroxietil-, vagy karboximetil-szubsztituenst tartalmaz. A találmány szerinti megoldásnál az enzimet vízoldhatatlan polimerhez, például egy térhálós dextránhoz is köthetjük, majd az így kapott komplexet megfelelő eljárással, például parciális hidrolízissel vagy dextranázzal való reakcióval vízoldhatóvá alakítjuk. A találmány szerinti megoldásnál oly módon is eljárhatunk, hogy az enzimet egy közbenső csoport segítségével kötjük a polimerhez. Ily módon az enzim egy híd segítségével kötődik a polimerhez. Közbenső csoportként dialdehideket például glioxált, vagy glicerinaldehidet, és/vagy diaminokat, mint 1,6-hexametiléndiamint, vagy etiléndiamint, és/vagy .a>co-amino-alifás-karbonsavat, mint glicint vagy e-aminohexánsavat alkalmazhatunk. A penicillin-dezaciláz enzimet a polimerhez változó arányban köthetjük. A polimer és enzim aránya 0,1-100:1 között lehet. A polimer és enzim arányát azonban célszerű 2 : 1 - 20 :1 érték között megválasztani. Az előállítás után a vízoldható enzim-komplexet felhasználás előtt tisztításnak vethetjük alá- Tisztítást végezhetjük ultraszűréssel vagy gélkromatográfiával, a gélkromatográfiához Sephadex G-100-at használunk fel. 2