169145. lajstromszámú szabadalom • Eljárás linkomicin előállítására
15 169145 16 használunk fel, a gátló zónákat standard lemezkorongon mérjük. A biológiailag aktív frakciókat egyesítjük, a szerves oldószert lepároljuk, és a maradékként kapott vizes oldatot fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított anyagot ezutárí metüén- ? kloriddal eldörzsöljük. A metilénkloridos oldatot szárazra pároljuk, és a maradékot acetonnal eldörzsöljük. Az elegyet szűrjük, és a szűrlethez étert adunk. A kivált csapadékot kiszűrjük, majd a szűrlethez 1 n metanolos sósavoldatot adunk. Színtelen 10 csapadék formájában linkomicin-hidroklorid válik ki. Ezt a csapadékot kiszűrjük, majd víz és aceton elegyéből átkristályosítjuk. Kristályos linkomicin-hidrokloridot kapunk. A találmány szerinti eljárásban a fent ismerte- 15 tett linkomicin-termelő törzSön kívül az adott törzs linkomicin-termelő variánsait vagy mutánsait is felhasználhatjuk. A mutánsokat ismert módszerekkel, például ultraibolya sugárzással vagy röntgensugárzással, nitrogénmustár felhasználásával, fágok alkal- 20 mázasával vagy hasonló műveletekkel alakíthatjuk ki az alaptörzsből. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példában részletesen ismertetjük. Amennyiben egyebet nem közlünk, a 25 %-os értékeken súly%-okat, a folyadékmennyiségeken pedig térfogatrészeket értünk. 30 Példa „A" lépés: Fermentáció (i) 28 C°-on végrehajtott fermentáció 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 100-100 ml 35 25 g/liter glükóz-monohidrátot és 25 g/liter „Pharmamedia"-t (gyapotmagliszt, a Traders Oil Mill Company, Fort Worth, Texas cég gyártmánya) tartalmazó csapvizet töltünk. Az elegy pH-ja sterilizálás előtt 7,2. A táptalajt sterilizáljuk, majd a steril 40 táptalajt Streptomyces vellosus NRRL 8037 mikroorganizmus ferde tenyészetével (tenyésztési közeg: talaj) oltjuk be. A lombikokat 3 napon át forgó rázógépen 28 C°-on inkubáljuk. 5-5 ml, fenti módon kapott oltótenyészettel 45 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba töltött, 100-100 ml térfogatú, alábbi összetételű fermentációs közegeket oltunk be: Glükóz-monohidrát 15 g/liter 50 159 Wilson's Peptone Liquor No. (hidrolizált állati eredetű fehérjéket tartalmazó készítmény) Difco élesztőkivonat (a Difco labor., Detroit, Michigan cég gyártmánya) Csapvíz 15 g/liter 55 2,5 g/liter q.s. 60 A közeg pH-ja sterilizálás előtt 6,0. A lombikokat forgó rázógépen (fordulatszám: 250/perc, lökethossz: 6 cm) 28 C°-on inkubáljuk. A fermentációt 96 óra elteltével állítjuk le. 65 (ii) 45 C°-on végrehajtott fermentáció Az (i) módszernél ismertetett oltótenyészettel 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba töltött, 100—100 ml térfogatú, alábbi összetételű fermentációs közegeket oltunk be: Glicerin NZ-amine B (kazein pankreásszal végzett lebontásával kapott, porszerű pepton-készítmény) Difco élesztőkivonat Nátriumklorid Csapvíz 30 g/liter 20 g/liter 2 g/liter 3 g/liter q.s. A közeg pH-ja sterilizálás előtt 7,2. 100 ml fermentációs közeghez 5 ml oltótenyészetet adunk. A lombikokat forgó rázógépen (fordulatszám: 250/perc, lökethossz: 6 cm) 45 C°-on inkubáljuk. A fermentációt 96 óra elteltével állítjuk le. „B" lépés: A linkomicin elkülönítése Az „A" lépés bármelyik módszere szerint végzett fermentációs műveletben képződött linkomicint a következőképpen különítjük el: a fermentlevet diatómaföld szűrési segédanyag felhasználásával szűrjük. A szűrőlepényt vízzel mossuk, és a mosófolyadékot egyesítjük a 6,5 liter térfogatú átlátszó szűrlettel.. Ezután a folyadékot vízzel átitatott Amberlite XAD-2 gyantaoszlopra töltjük, és az oszlopot 1,5 liter, 95:5 térfogatarányú metanol—víz eleggyel eluáljuk. Az eluátumot 250 ml-es frakciókba gyűjtjük, és az egyes frakciókat vékonyrétegkromatográfiás elemzésnek (adszorbens: szilikagél, futtatószer.: 186 : 52 : 20 térfogatarányú metil-etil-keton/acetón/víz elegy) vetjük alá. A hatóanyagot (Rf = 0,42) tartalmazó 1-5. frakciót egyesítjük, a szerves oldószert lepároljuk, és a vizes maradékot fagyasztva szárítjuk. A kapott száraz anyagot metilénkloriddal eldörzsöljük, és a metilénkloridos oldatot szárazra pároljuk. A kapott maradékot acetonnal eldörzsöljük. Az oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrlethez étert adunk. A kivált csapadékot kiszűrjük, és a szűrlethez 1 n metanolos sósavoldatot adunk. A színtelen csapadék formájában kivált linkomicin-hidrokloridot kiszűrjük, majd víz és aceton elegyéből kristályosítjuk. 220 mg linkomicin-hidrokloridot kapunk. A linkomicin-hidroklorid ásványolajos szuszpenzióban felvett infravörös abszorpciós spektrumában a következő jellemző sávok észlelhetők: 3340, 3240, 3150, 3080, 2160, 1690, 1676, 1600, 1590, 1313, 1305, 1276, 1265, 1233, 1185, 1155, 1140, 1100, 1093, 1078, 1042, 1006, 990, 970, 924, 906, 875, 855, 827, 793 és 690 cm-1 . A termék infravörös spektruma teljes mértékben megegyezik a 3 086 912 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint előállított, majd kromatográfiás úton, átkristályosítással és ellenáramú meg-8
