169138. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malac-colibacillosis vakcina előállítására vemhes kocák számára
3 169138 4 után dolgozzuk fel vakcinává, az így kapott sterilezett anyagot liofilizáljuk, majd közvetlenül az adjuváns hozzáadása előtt hidratáljuk. Adjuvánsként tetszés szerint olyan ismert terméket vagy kompozíciót alkalmazhatunk, amely 5 hozzájárul a nagy immunválasz biztosításához. Ilyen adjuvánsokra példaként az alumínium-tartalmú géleket említjük meg, így az alumíniumhidroxidot, az alumíniumfoszfátot, továbbá a Superfos Export cég által (Koppenhága, Dánia) „Alhydro- 10 gel" márkanév alatt forgalombahozott alumíniumhidroxid gélt. Hordozóanyagként továbbá víz az olajban típusú emulziókat is alkalmazhatunk, így a „65" adjuvánst (az antigén kókuszolajban elkészített, mannit-monooleátot tartalmazó víz az olajban 15 típusú emulziója, amelyet alumínium-monosztearáttal stabilizálnak). Alkalmazhatjuk továbbá a Freund-féle adjuvánst (elölt Mycobacterium tuberculosist tartalmazó víz az olajban típusú emulzió, amely olajkomponensként ásványolaj könnyűpária- 20 tot, emulgeálószerként mannit-monosztearátot tartalmaz). A találmány szerinti eljárás igen lényeges vonása, hogy a vakcina előállításához az E. coli olyan enteropatogén szerotípusát használjuk, amely- 25 nek enterotoxinja a feni említett meglepő hatást, nevezetesen a más szerotípusokkal szembeni immunitás kifejlődését biztosítja. Az ehhez a szerotípushoz tartozó törzset az American Type Cultre 'Collection intézménynél (Maryland, Rock- 30 ville, Amerikai Egyesült Államok) 21 972 számú alatt helyeztük letétbe. A találmány szerinti eljárással előállított vakcina nemcsak a hőérzékeny enterotoxin által okozott colibacillosis, hanem a hőálló enterotoxin által 35 okozott colibacillosis ellen is védelmet ad. A vakcinát az elles előtt 3—6 héttel adjuk be a vemhes kocáknak. Ekkor egyrészt az állatok föcstejében és tejében képződnek antitestek, másrészt a kismalacok közvetlen védettséget 40 szereznek az E. coli fertőzéssel szemben. A vakcinát intramuszkulárisan vagy szubkután úton lehet beadni a vemhes kocának. A hatásos dózis a legalább 5 mg, előnyösen azonban 10—150 mg szárazanyagot tartalmazó vakcina. 45 Alkalmazhatjuk azonban az utóbb említett mennyiség többszörösét is. A találmány szerinti eljárást — az oltalmi kör korlátozása nélkül — az alábbiakban példákon mutatjuk be. 50 1. példa Szilárd tápközeg készítése 55 10 liter vizet hozzáadunk 130g Bacto-Tryptose bouillonhoz és 150 g Bacto-agarhoz [mindkét terméket a Difco Laboratories cég (Detroit, 1, Michigan, Amerikai Egyesült Államok) hozza 60 forgalomba]. Az elegyet keverés közben 60 percen keresztül 121 C°-on melegítjük. 20 g Bacto-dextrose-t (forgalmazó: Difco Laboratories cég) felok dunk 20 ml desztillált vízben és az oldatot 0,45 mikron hézagméretű Millipore Csteril szűrőn 65 szűrjük keresztül (gyártó: Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok). A két elegyet összeöntjük és az egyesített termékből 110 ml-es részleteket mérünk ki 500 ml-es Roux-lombikokba. Oltótenyészet készítése ATCC 21 972 jelű liofilizált E. coli törzset steril sóoldattal hidratálunk, majd 18 órán keresztül 37 C°-on 20 ml Tryptose-agar szilárd tápközeget tartalmazó Petri-csészékben inkubálunk. A tápközeget úgy készítjük el, hogy 26 g Tryptose bouillont és 30 g Agar-difco-t vízzel ( 1 liter térfogatra egészítünk ki, majd az elegyet 45 percen keresztül 115C°-on melegítjük. A továbbiakban PP3 -nak nevezett folyékony tápközeget a következőképpen készítjük el: 30 g Proteose peptone N° 3-t (gyártó: Difco Laboratories cég), 4 g élesztőextraktumot és 5 g dextrózt 60 C°-on feloldunk 1 liter vízben. Az elegyet lehűtjük, majd 5 g nátriumkloridot, 5,05 g nátriumhidrofoszfátot és 1,2 g káliumdihidrogén-foszfátot adunk hozzá. A 6,9-7,0 pH-jú közeget Seitz EKS szűrőn szűrjük és 100 ml-es lombikokba adagoljuk. A lombikokban levő táptalajt 1 telep|20 ml PP3 tápközeg arányban beoltjuk a Petri-csészékben kitenyésztett kis telepekkel, majd a lombikokat rázóasztalon 22—24 rázás/perc sebességgel 6 órán keresztül 37 C°-on inkubáljuk. E. coli fermentálása A PP3 tápközegben előállított E. coli tenyészet 4 ml-es aliquot részeit (kb. 4.109 baktérium) átoltjuk a tápközeget tartalmazó 500 ml-es Roux-lombikokba, majd a lombikokat rázóasztalon 1 napon keresztül 37 C°-on inkubáljuk 22-24 rázás/perc sebesség mellett. Az elkülönített sejttenyészeteket 25 ml desztillált vízben szuszpendáljuk, 15 Roux-lombikból kapott tenyészetet (egy sorozat) 1 literes lombikba öntünk össze. A tisztaságvizsgálathoz az egyes sorozatokból 1 ml-t veszünk ki. 0,5 ml fentiek szerint előállított tenyészetet Petri-csészében levő Tryptose-agar bouillonba oltunk át és 7 napon keresztül 34 C°-on inkubálunk. További 0,5 ml-es frakciókat 20 ml Sabouraud-dextróz agar tápközeget tartalmazó Petri-csészékbe viszünk át és a tenyészetet 7 napon keresztül 22 C°-on inkubáljuk. A tápközeget úgy állítjuk elő, hogy 65 g Sabouraud-dextrose agar-Difco-t (gyártó: Difco Laboratories cég) 1 liter meleg desztillált vízben feloldunk, majd az oldatot sterilizáljuk. Az elkülönített sejtszuszpenzióhoz steril 1%-os neomicin-szulfát oldatot adunk, 100 ml, sejtszuszpenzióra 1,2 ml neomicin-szulfát oldatot számítva. A sejteket ezután 30 percen keresztül „Branson Europa sonicator model J 22" ultrahangos sejtfeltáró készülékkel kezeljük (gyártó: Brassón Europa N. V., Soest, Hollandia). ' A kezelés közben a szuszpenziót vizes jégfürdőn tartjuk. Ezután a szuszpenziót 2 órán keresztül 2 550 fordulat/perc sebességgel 5 C°-on centrifugáljuk és így a sejttörmeléket eltávolítjuk. 2
