169119. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem-patogén bovin rhinotracheitis vírustörzs és élő legyengített bovin rhinotracheitis virus-vakcina előállítására
9 169119 10 2. példa Embrionális bovin veséket aszeptikus körülmények között elkülönítünk, aprítunk, foszfátpuffer-sóoldat (összetétel: 8g NaCl, 0,2 g KCl,'l,15g 5 Na2HP0 4 , 0,2 g KH2 P0 4 , desztillált víz ad 800 ml) és 100 ml desztillált vízzel készített MgCl2 • 6H 2 0 oldat keverékével, majd 0,1 g CaCl 2 100 ml desztillált vízzel készített oldatával mossuk, a végső oldatot, amelynek pH-ja 7,2 és 7,4 közötti 10 érték, sterilizáljuk, és 2,5 g/liter koncentrációjú pufferolt sós tripszin-oldattal tripszinezzük. Az elegyet 10 percig 37 C°-on keverjük. Ezután a folyadékot eltávolítjuk, és azonos térfogatú friss tripszin-oldattal helyettesítjük. A tripszinezést a szövet teljes 15 kimerüléséig folytatjuk, eközben a folyadékban szuszpendált sejteket időről időre elkülönítjük. Végül a szuszpenziót 5 percig 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, és a sejtüledéket növesztő táptalajban (10%-os vírusmentes borjúszérummal, 20 0,5% laktalbumin-hidrolizátummal, 0,1% élesztőkivonattal és 50 mcg/ml neomicin-szulfáttal kiegészített Hank-féle alap-sóoldat) szuszpendáljuk. Körülbelül 200 000 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítünk. 25 l-l ml így kapott elegyet 500 cm2 felületű Roux-lombikokba töltünk, és 4—5 napig 37 C°-on inkubáljuk. E kezdeti inkubációs szakasz után a növesztő közeget eltávolítjuk, és a sejt-egyréteget a 30 fenntartó közeggel kétszer mossuk. A fenntartó közeg Eagle-féle alap-sóoldat, amely adalékként 0,5% laktalbumin-hidrolizátumot, 0,1% élesztőkivonatot, 0,1% triptóz-foszfát-táptalajt és 50 mcg/ml neomicin-szulfátot tartalmaz. 35 A bovin embrionális vese-sejttenyészetet tartalmazó lombikokat l-l ml IBR RLB 106 vírustörzs desztillált vizes szuszpenziójával oltunk be. A szuszpenzió koncentrációja körülbelül 2 x 106 40 TCIDs o/ml (azaz a többszörözési index 0,1). Minden lombikba a fent ismertetett mosófolyadékkal azonos összetételű fenntartó közeget adunk, és a tenyészeteket nagymennyiségű vírus kialakulását lehetővé tevő ideig -azaz, amint a tipikus IBR 45 citopatogén hatás mérésével kimutattuk, legalább 3—4 napig - 35 C°-on inkubáljuk. dinátrium-hidrogénfoszfát oldat, 25 ml 1/15 mólos kálium-dihidrogénfoszfát oldat, 20 g monokálium-glutamát, desztillált víz ad 1 liter) 1 :2 térfogatarányban hígítjuk. A megengedett hőmérsékleten (30 C°) és a meg nem engedett hőmérsékleten (39 C°) végzett vírus-titrálások eredményei azt igazolják, hogy a kiindulási IBR RLB 106 törzs megtartotta hőmérséklet-érzékeny jellegét. A kapott készítmény vírus-koncentrációja 10 s ,2 TCID 50 /ml. A kapott készítményt 10 s' 2 TCID S0 vagy ennek többszörösét kitevő vírus-mennyiségben üveg-fiolákba osztjuk szét, fagyasztva szárítjuk, és a fiolákat lezárjuk. Egyetlen dózist, illetve több dózist tartalmazó szárazampullás készítményeket kapunk. Felhasználáskor a szárazampullákhoz dózisonként 1 ml vizet adunk, és orrcseppként vagy orr-permetként adjuk be az állatoknak. A vakcina jellemzői: Amint a 4. táblázat adataiból kitűnik, a kapott vakcina hőmérséklet-érzékeny jellege nem különbözik az IBR RLB 106 vírustörzs hőmérséklet-érzékeny jellegétől. 4. táblázat Vizsgált anyag Vírus-faktor (TCIDJO) logi o/0,l ml egységekben 37 C°-on 38 C°-on 39 C°-on Vakcina 5,5 5,7 0,5 IBR RLB 106 törzs 4,3 4 0,5 A kapott vakcina kísérletes vizsgálata: (a) Kezelésmód A felső folyadékfázisokat elkülönítjük, egyesítjük és stabilizáló oldattal („FG-oldat", Összetétel: 50 60 g kaziton, 100 g szacharóz, 75 ml 1/15 mólos A vakcinával három 3-4 hetes nőstény borját (Middle Belgium faj) oltunk be, míg egy állatot kontrollként tartunk vissza. Az adagolás módját az 5. táblázatban közöljük, (in = intranazális) 5. táblázat Állat száma Kezelés módja Beadott dózis Fertőzés i módja Fertőző dózis log10 TCID 50 log10 TCIDJO 72 in 2 x 6,5 in 2x6,7 74 in 2x6,5 in 2x6,7 88 in 2x6,5 in 2 x 6,7 85-— — in 1x6,7
