169113. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin és pankreász-por kinyerésére
3 169113 4 szerves oldószer eltávolításával kicsapjuk, majd önmagában ismert módon tisztítjuk, az extrakciós maradékot — az inzulin-mentes pankreász-port — vákuumszárítással megszárítjuk. A találmányunk szerinti megoldásban új az egy- 5 vegyértékű só jelenléte az extrahálószerként szolgáló vizes-szerves oldószerben. A találmányunk szerinti eljárást savak hozzáadása nélkül, csak vizes-szerves oldószerekkel végezzük, kiváltképpen vizes etanollal. Az egyvegyértékű 10 sók erős sózási hatását hasznosítjuk, erre a célra szervetlen sóként előnyösen nátriumkloridot használunk. Az extrakciós oldat pH-ját az enzimek stabilitási optimumának megfelelően körülbelül 6-ra állítjuk. Az előnyösen alkalmazott etanol helyett 15 más szerves oldószert is (például acetont, vagy metanolt) használhatunk. A legkedvezőbb eredmények azonban etanollal kaphatók. A szerves oldószer elkülönítése például desztillációval végezhető. Ezáltal egy vizes maradék ma- 20 rad vissza, amelyben az egyvegyértékű só olyan nagy töménységű, hogy az inzulint kisózza, tehát oldhatatlanná teszi. A találmányunk szerinti eljárás kiindulóanyagát fagyasztott és 1 mm részecskeméretnél kisebbre ap- 25 rított hasnyálmirigyekből fagyasztott állapotban standard fagyasztva szárító berendezéssel végzett gyors vákuumszárítással és ezt követően valamely zsíroldószerrel - például szénhidrogénnel, így benzinnel vagy benzollal, vagy klórozott szénhidro- 30 génnel, így metilénkloriddal, kloroformmal vagy széntetrakloriddal - végzett zsírtalanítással kapjuk, eközben a hasnyálmirigyek enzim- és inzulin-tartalma teljesen megmarad. A mirigyek inzulin-tartalma 5 és 12 mg/100 g közötti, a kinyerésre alkal- 35 mázott állatok korától és a visszamaradt, nem a hasnyálmirigyhez tartozó szövetek által okozott szennyezéstől függően. A találmány szerinti eljárással lehetővé válik az említettek szerint előállított kiindulóanyagból inzulin elkülönítése és olyan szi- 40 lárd halmazállapotú pankreász-por kinyerése, amelynek fajlagos enzimaktivitása gyakorlatilag teljes mértékben megegyezik a kiindulóanyagéval. A következő példák a találmány szerinti eljárás magyarázatára szolgálnak: 45 1. példa Hasnyálmirigyből fagyasztásos szárítással, majd 50 zsíroldószerrel végzett zsírtalanítással kapott inzulin-tartalmú pankreászenzim-termék 10 kg-os mennyiségét 150 liter 70%-os vizes etanollal, amely 3,5 kg nátriumkloridot tartalmaz, 30 percig 0 C°-on keverünk és a terméket nuccson leszívatjuk. Az 55 extrakciós maradékot képező pankreász-port vákuumban azonnal szárítjuk. A tiszta szűrletről az alkoholt vákuumban ledesztilláljuk és az ily módon kisózott inzulint centrifugálással kinyerjük, majd a zsírszerű alkotók eltávolítására 10 liter alkohollal 60 extraháljuk és a maradékban visszamaradó inzulint, 2,5 pH-nál végzett vizes feloldás után, 12%-os vizes nátriumklorid-oldat hozzáadásával ismét kisózzuk. További tisztítás céljára a csapadékot 4,5%-os nátriumkloriddal, 5 g etiléndiamin-tetraecetsav hozzá- 65 adásával 6,6 pH-nál keverjük, eközben az inzulin oldódik. Ebből az oldatból cinkacetát hozzáadásával kicsapjuk az inzulint, a cinkinzulin csapadékot kevés sósavval 2,5 pH-nál feloldjuk és egy megfelelően térhálósított molekulaszitán kromatografáljuk. (Eluálószer: 1 mólos ecetsav, 1% NaCl.) A kapott frakciókból az inzulint nátriumklorid hozzáadásával kicsapjuk és kristályosítjuk. A kristályos inzulin kitermelése 3 g, milligrammonként 28 nemzetközi egységű (I. E.) biológiai aktivitású anyag (a Német Demokratikus Köztársaság-beli 7. Gyógyszerkönyv alapján). A kiindulóanyagként alkalmazott pankreászenzim-terméket (10 kg) 50 kg mennyiségű technikai minőségű hasnyálmirigyből kaptuk és így az erre vonatkoztatott kristályos inzulin kitermelése 6 mg/100 g. Az előzőkben ismertetettek szerint extrahálással és vákuumszárítással kapott pankreász-por minőségét az inzulin extrakciója előtti, illetve utáni specifikus enzimaktivitások összehasonlítása szemlélteti. Enzim Extrakció előtt Extrakció után Lipáz 44 500 43 000 Amiláz 45 000 41 000 Kimotripszin 11 680 9 750 Tripszin 2 980 2 980 Az enzimegységeket standard eljárásokkal határoztuk meg, és I. E./g. Pankreatin egységekben adjuk meg. 2. példa Hasnyálmirigyből fagyasztásos szárítással, majd zsíroldószerrel végzett zsírtalanítással kapott, inzulin-tartalmú pankreászenzim-termék 100 g-os mennyiségét 1500 ml 70%-os vizes acetonban szuszpondáljuk, mely 50 g nátriumkloridot tartalmaz, az oldatot az 1. példában megadott módon extraháljuk és feldolgozzuk. Az inzulin kitermelése az 1. példában megadottnak felel meg. Az extrakció után a következő specifikus enzimaktivitásokat találtuk: Lipáz 30 700 Amiláz 30 200 Kimotripszin 5 050 Tripszin 3 450 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás inzulin és teljes specifikus enzimaktivitással (lipáz, amiláz, tripszin, kimotripszin) rendelkező inzulin-mentes pankreász-por kinyerésére, 2
