168902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-triptofán és származékai folyamatos fermentációs előállítására
3 168902 4 talajmintákból elkülönített több, mint 600 mikroorganizmus-törzs vizsgálata alapján választottuk ki, és a Centraal-Bureau voor Schimmelcultures intézetben J IA CH XII (CBS 6434) számon helyeztük letétbe. 5 A 2 108 214 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli közrebocsátási iratból ismert, hogy egyes Candida humicola törzsek treonin-aldolázt termelnek, és az így termelt enzim L-szerin mikrobiológiai szintézisében alkalmazható. E közrebo- 10 csátási irat azonban semmiféle útmutatást nem tartalmaz arra vonatkozólag, hogy Candida humicola törzsek L-triptofán folyamatos mikrobiológiai szintézisében is alkalmazhatók lennének. 15 A találmány szerinti fermentációs eljárással, Candida humicola törzs felhasználásával előnyösen az (I) általános képletű triptofán-származékokat állítjuk elő, ahol R jelentése hidrogénatom, hidroxil-csoport, halogénatom, rövidszénláncú alkil-csoport 20 vagy rövidszénláncú alkoxi-csoport. E vegyületek nagy része a gyógyszeripar szempontjából rendkívül értékes, és a piacon magas áron kerül forgalomba. Az (I) általános képletű triptofán-származékokat 25 a • találmány szerint úgy állítjuk elő, hogy a Candida humicola mikroorganizmus-törzset aerob körülmények között folyamatosan bevezetett táptalajon tenyésztjük, miközben külön áramban, folyamatosan a megfelelő (II) általános képletű indol- 30 -származékot — ahol R jelentése a fenti — vezetjük a rendszerbe. A II általános képletű kiindulási anyagok ismert vegyületek. Előállítási eljárásukat az alábbi irodalmi helyek ismertetik: Berichte, 95, 2205 (1962), Phar- 35 maceutica Acta Helvetiae, 41, 109 (1966), 2 057 840 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat. A találmány szerint felhasznált mikroorganizmus igen nagy triptofán-szintetizáló kapacitással rendelkezik. Tekintettel arra, hogy a mikroorganizmus 40 érzékeny a táptalaj túl nagy indol-koncentrációjára az indol-vegyüíetet folyamatosan kell a tenyészetbe adagolni. A mikroorganizmust pontosan meghatározott táptalajon tenyészthetjük, és a mikroorganizmus növekedéséhez szénhidrátokon és tiaminon 45 kívül semmiféle más szerves anyagra nincs szükség. A Candida humicola törzs anyagcseréje során a triptofánt is részben lebontja. A bomlás első lépése a triptofán-piroláz enzim hatására megy végbe. Ez az enzim azonos a triptofán-2,3-dioxigenáz enzim- 50 mel, amely az l-triptofán átalakulását katalizálja formil-kinureninné [J. Bacteriol., 62, 691 (1951), J. Biol. Chem., 234, 1162 (1959)]. A tenyésztés körülményeit és a táptalaj összetételét megfelelően változtatva azonban oly mértékben visszaszorít- 55 hatjuk a triptofán lebomlását, hogy a gyakorlatban nem észlelünk triptofán-hozamcsökkenést. Annak következtében, hogy a törzs e tekintetben vad típusnak tekinthető, folyamatos tenyészetben igen hosszú ideig tenyészthető anélkül, hogy negatív 60 mutánsokat képezne. A triptofán-lebontó hatással nem rendelkező mutánsok képződésének elősegítése érdekében a táptalajhoz körülbelül 0,05-0,5 g/l mennyiségű niacint adhatunk. 65 A betáplált indol a sejtfalon áthaladva a sejten belüli enzimrendszerek hatására triptofánná alakul. Az átalakulás gyakorlatilag teljes mértékben végbemegy. A szabad indol már viszonylag kis koncentrációban is csökkentheti a sejtek növekedési sebességét. Figyelembe véve azonban, hogy az indol -triptofán átalakulás rendkívül gyorsan zajlik le, például a táptalajra vonatkoztatott 0,5 vegyes % indol beadagolásakor csak igen kis mennyiségű szabad indol mutatható ki a fermentleben. A fermentlé indol-tartalmának meghatározása során a sejttartalmú fermentlevet kell vizsgálni, ugyanis a szabad indol legnagyobb része a sejten belül található. Az indol triptofánná alakulásának sebességét és a triptofán kinurenin-képződés közben végbemenő bomlásának mértékét elsősorban a biológiailag hasznosítható vas (például vas(II)citrát) koncentrációja szabja meg. A táptalaj Fe2+ koncentrációjának kisebbnek kell lennie a triptofán-bomlást elősegítő értéknél, azonban meg kell haladnia azt a kritikus értéket, amely alatt a tenyészet növekedése nagymértékben gátolt, és így folyamatos tenyésztés nem hajtható végre. Figyelembe véve, hogy a triptofán-piroláz enzim hemo-csoportot tartalmaz, és a triptofán bomlása oxidációs folyamat, a triptofán bomlási sebességét a fermentlé biológiailag hasznosítható oxigén-tartalma is nagymértékben befolyásolja. Kis levegőztetési sebesség (kevés oxigén beadagolása) esetén a tenyészet Fe2 + tartalmát viszonylag nagyobb értéken tarthatjuk, míg a levegőztetés sebességének fokozásával csökkentenünk kell a Fe2+ koncentrációját. Ezek a feltételek a nem-mutáns Candida humicola mikroorganizmus-törzsre érvényesek. Az általános tenyésztési körülmények (a szubsztrátum összetétele, elsősorban a niacin jelenléte, és az indol-adagolás megfelelő szabályozása) következtében hosszabb ideig tartó folyamatos tenyésztés során a tenyészetben triptofánt le nem bontó mutánsok alakulnak ki. Ha ilyen mutánsok már kialakultak, a Fe2+ koncentráció növelése már nem jár a triptofán lebomlásával, így a táptalajban szén forrásként nagymennyiségű Fe2+ iont tartalmazó anyagokat, például melaszt is felhasználhatunk. A fermentáció során több méréssel ellenőrizzük, hogy az indol adott betáplálási sebességekor a fermentorban jelenlevő maradék indol koncentrációja nem haladja-e meg a növekedést gátló kritikus értéket. A maradék indol-koncentráció növekedésével nagymértékben növekszik a titrálás gyakorisága és az oxigénnel való telítettség mértéke, ugyanis az aerob anyagcsere anaerobbá válik. Ezeket az értékeket figyelemmel kísérjük, és ennek megfelelően szabályozzuk a vascitrát adagolását, illetve a levegőztetés sebességét. A sejttérfogatot is mérjük, itt azonban a változás olyan lassú, hogy a mérési eredmények nem használhatók fel a folyamat szabályozására. A maradék indol-tartalmat sejttartalmú fermentlé gázkromatográfiás vizsgálatával, metanolban oldott o-nitro-fenil-etanol belső standard felhasználásával határozzuk meg. Tekintettel arra, hogy az 2
