168850. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítására

11 16885° 12 -sokkal intenzívebb sáv 110 000 molekulasúlynál, a keresett protein sávja, - nagyobb molekulasúlyoknál egy vagy két sáv, ezek vagy szennyeződések vagy az előző két frakció polimerjei. F 950 jelű termék - kis intenzitású sáv a monomer-albumin szintjén, valószínűleg albumin-szennyeződés, - sokkal intenzívebb sáv 120 000 molekulasúlynál, a disznóból kipreparált termék molekulasúlya valószínűleg valamivel nagyobb az emberi eredetű anyagénál. F 952 jelű termék - az albumin-monomer szintjén nem figyelhető meg elkülönülő sáv, -a 120 000 molekulasúlynál megállapítható sáv megerősíti a korábban feltételezett molekulasúlyt. e) Kvantitatív immunelektroforézis A kvantitatív immunelektroforézissel előhívható a tanulmányozott protein, megállapíthatók a protein szennyeződései vagy az előzőkben ismertetett módszerekre támaszkodva pontosan megadhatók a szennyeződések és adott esetben a szennyeződések mennyisége. 1) Kétdimenziós immunelektroforézis. Kísérlet: 0,6 g F 947 jelű anyagot 3 pl térfogatban szuszpendálunk. A terméket immunszérumot nem tartalmazó 1%-os agaróz-gélben 10 V/cm potenciálkülönbség mellett 1 órán keresztül futtatjuk. Ilyen módon 2,5 cm széles gélsávot kapunk (az elektroforézises migrációs sávnak megfelelően). A gélsávot eltávolítjuk, ez lesz az új lemez katódos vége. A készülék maradék felületét 1% nyúl immunszérum teljes humánantiszérumot tartalmazó 12 ml agaróz-oldattal fedjük be, majd az előző futtatásra merőlegesen elektroforézist végzünk. (Az antiszérum előállítója: Behringwerke, sorozatszám: T 1585 AZ). Az elektroforézis során kis potenciálkülönbséget 2,5 V/cm-t alkalmazunk 16 órán keresztül. A művelet során egyrészt elektroforetikus migráció, másrészt antigén-antitest csapadékképződés játszódik le. Eredmények: Az előzőtől különböző módon megállapítottuk az albumin-mobilitású sáv jelenlétét. A j3-mobilitásnak megfelelő csapadék-vonal igen kis szennyeződésre utal. Kettős futtatás albuminnal és polivalens humán antiszérum immunszérummal A kísérlet célja annak megállapítása, hogy az albuminmobilitású protein albumin vagy a tanulmányozott protein. A futtatást két lépésben végezzük: - Az első futtatás során a különböző típusú mintákat egymástól 1 cm távolságra fekvő indulási 5 pontokból indítjuk, majd egymásután futtatjuk immunszérumot nem tartalmazó agaróz-gélben. Ugyanazon a lemezen párhuzamosan 4 fentivel azonos futtatást végzünk. A futtatás végén a párhuzamos kísérleteknek megfelelő 4 hasonló sávot 10 levágjuk. — A második futtatás során az egyik sávot új sávként a katód-oldalra helyezzük, majd a sávot a lemez immunszérumot tartalmazó agaróz-gél részére migráltatjuk rá. A második futtatást az elsőre 15 merőleges irányban végezzük. A kísérlet során nagy felületű, homályos körvonalú egyedi csúcsot figyeltünk meg, ez valószínűleg a keresett proteinnek felel meg. 20 3) Kettős futtatás albuminnal és humán antialbumin immunszérummal A közös antigén-jellemzők megállapítására megismételjük a korábbi kísérletet, az összehasonlítóként 25 alkalmazott albumin mennyiségét azonban csökkentjük és humán antialbuminspecifikus immunszérumot alkalmazunk. Kísérlet: 30 Az előző kísérletben ismertetettek szerint járunk el. Az albumin-minta 0,7 Mg standard albuminnak felel meg (Behringwerke). A mintát 4M1 térfogat-35 ban szuszpendáltuk. A kísérlet során 4/J-ben felvett 0,8 mg F 947 jelű terméket vizsgáltunk. Az első futtatást 1 órán keresztül végeztük 10 V/cm potenciálkülönbség mellett. 40 Az első lemezről négy futtatási csíkot vágtunk le. Az egyik sávot a második futtatás során a katódhoz helyeztük. A lemezt 12 ml 0,8% humán antialbumin nyúl immunszérumot tartalmazó 45 agaróz géllel egészítettük ki (Behringwerke gyártmány, T 2139 A sorozat). Az első futásirányra merőleges második futtatást 16 órán keresztül végeztük 2,5 V/cm potenciálkülönbség mellett. 50 A futtatás segítségével két elkülönülő csúcs állapítható meg, az egyik az összehasonlító albuminnak, a másik a valószínűleg albumin-típusú szennyeződésnek felel meg. 55 4) Laurell-féle immunkémiai meghatározás Miután megállapítottuk, hogy a szennyeződés albumintermészetű, mennyiségét immunokémiai módszerrel becsüljük meg. Erre a célra a Laurell-60 -féle eljárást alkalmazzuk. Kísérlet: A standard sorozatot 4/d térfogatú Behring-65 werke-féle standardokkal készítjük. 6