168781. lajstromszámú szabadalom • Eljárás androsztánvázas szteroidok előállítására
3 168781 4 Korábban megállapítottuk, hogy a Mycobacterium phlei (MNG 29) törzs a természetes szterineket előnyös termeléssel l,4-androsztadién-3,17-dionná alakítja át fémkomplex-képzők jelenlétében (Wix Gy., Büki K., Tömörkény E. és Ambrus G.: Steroids 11, 401 (1968); Ambrus G., Tömörkény E. és Büki K.: Experientia 24, 432 (1968)]. A törzs szteroidátalakító képességének további vizsgálata során azt a felismerést tettük, hogy ez a mikroorganizmus nemcsak a természetes szterinek oldalláncát képes lebontani, hanem a természetes szterinek rövidszénláncú alifás alkoholokkal képzett étereinek oldalláncát is. Megvizsgáltuk a koleszterin metil-, etil-, n-propil-, i-propil-, n-butil-, hexadecil-, ciklopentil-, ciklohexil- és 2-hidroxi-etil-éterének átalakíthatóságát és meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a koleszterin metil-, etil-, n-propil- és i-propil-étere a megfelelő dehidroepiandroszteron-éterré alakult át, míg a többi vizsgált koleszterin-éter oldallánca nem, vagy csak nagyon kis mértékben bomlott le. Hasonló megfigyeléseket tettünk egyéb szterinek különböző étereinek átalakításakor is. A dehidroepiandroszteron-alkil-éterek közvetlenül nem használhatók szteroidhormonok szintézisének kiindulási anyagául. Az alkil-éter védőcsoport eltávolítására irányuló kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy perklórsav jelenlétében, ecetsavanhidrides közegben a dehidroepiandroszteron alkil-éterei előnyös termeléssel dehidroepiandroszteron-3-acetáttá alakulnak át, melyből ismert módon hidrolízissel dehidroepiandroszteron nyerhető. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás az I általános képletü vegyületek előállítására —• ahol X jelentése hidrogénatom vagy acetil-csoport vagy 1—-3 szénatomszámú egyenes vagy elágazó szénláncú alkil-csoport. Az eljárás abban áll, hogy a) olyan I általános képletü vegyületek előállítása esetén, ahol X jelentése 1—3 szénatomszámú alkil-csoport, a kiindulási vegyületként használt II általános képletü szterin-vegyületet — ahol Rí 1—3 szénatomszámú alkil-csoportot, R2 hidrogénatomot, 1—-2 szénatomszámú alkil-csoportot, a—b pedig egyes vagy kettős kötést jelent — aerob körülmények között Mycobacterium phlei (MNG 29) törzzsel fermentáljuk, vagy b) olyan I általános képletü vegyületek előállítása esetén, ahol X jelentése acetil-csoport, a kiindulási vegyületként használt II általános képletü szterin-vegyületet — ahol Rt 1—3 szénatomszámú alkil-csoportot, R2 hidrogénatomot, 1—2 szénatomszámú alkil-csoportot, a—b pedig egyes vagy kettős kötést jelent — aerob körülmények között Mycobacterium phlei (MNG 29) törzzsel fermentáljuk, majd a kapott terméket perklórsav jelenlétében ecetsavanhidriddel kezeljük, vagy c) olyan I általános képletü vegyületek előállítása esetén, ahol X jelentése hidrogénatom, a kiindulási vegyületként használt II általános képletü szterin-vegyületet — ahol Rt 1—3 szénatomszámú alkil-csoportot, R 2 hidrogénatomot, 1—2 szénatomszámú alkil-csoportot, a—b pedig egyes vagy kettős kötést jelent — aerob körülmények között Mycobacterium phlei (MNG 29) törzzsel fermentáljuk, majd a kapott terméket perklórsav jelenlétében ecetsavanhidriddel kezeljük, és az így kapott vegyületet hidrolizáló ágenssel hidrolizáljuk. A mikrobiológiai átalakításhoz használt Mycobacterium phlei (MNG 29) törzset agart, növényi eredetű fehérjét, pl. burgonyakivonatot és szénforrásként valamilyen szénhidrátot, pl. glükózt tartalmazó szilárd 5 táptalajon tenyészthetjük. A mikroorganizmus 4—20 napig 20—40 C°-on végzett inkubálása után a kinőtt tenyészet 4—6 hétig használható oltóanyagként. A mikroorganizmus tömegtenyésztését aerob süllyesztett kultúrában rázott lombikban vagy fermentorban 30—45 C° 10 hőmérsékleten végezhetjük. A levegőztetés és keverés mértékét széles határok között lehet változtatni. A felhasznált táptalajban nitrogén-forrásként előnyösen kukoricalekvárt alkalmazhatunk (1—5%). Más nitrogénforrások is alkalmasak a növesztésre, mint pl. glu-15 taminsav, aszparagin vagy természetes anyagok nitrogéndús kivonatai, mint pl. élesztőkivonat, pepton, kazein-hidrolizátum, felfőzött szójaliszt leve stb. A táptalajba szénforrásként előnyösen használhatunk glicerint (0,5—-2,5%), de magas biokémiai aktivitású tenyészete-20 ket nyerhetünk egyéb könnyen metabolizálható szénhidrátok, pl. glükóz, fruktóz és mannit alkalmazásával is. A 121 C°-on gőzzel sterilezett folyékony táptalajt a szilárd táptalajról lemosott Mycobacterium phlei 25 (MNG 29) törzs sejtjeinek szuszpenziójával oltjuk. Az 1 liternél nagyobb térfogatú táptalajokat a beoltandó táptalaj-térfogat 1—10%-ának megfelelő mennyiségű süllyesztett kultúrával célszerű inokulálni. A tenyészet növekedését a fermentléből kiülepíthető 30 sejt-szárazanyag tartalom meghatározásával követjük. 20—40 órán át 37 C°-on végzett növesztés után a tenyészet szárazanyagtartalma 0,3—0,7%, és a sejtek elérik maximális biokémiai aktivitásukat. Ezután a sejteket elválasztjuk a növesztő táptalajtól és desztillált 35 vízben vagy híg konyhasó-oldatban vagy pufferben (pH 6—8) szuszpendáljuk. Az így nyert sejtszuszpenzióhoz adagoljuk az átalakítandó szterin-alkil-étert vízzel elegyedő szerves oldószerben, célszerűen acetonban oldva. 40 A szterin-alkil-éterek átalakítását aerob körülmények között a növesztés hőmérsékletén, célszerűen 37 C°-on, intenzív keverés mellett 2—3 napig végezzük. A szterin-alkil-éterek dehidroepiandroszteron-alkil-éterekké való átalakulását a fermentációs folyadék 1,2-diklóretános 45 extraktumának vékonyréteg-kromatográfiás analízisével követjük nyomon. Az átalakulás befejeződése után a fermentációs folyadékot vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen 1,2-diklóretánnal extraháljuk. Az extrakcióval kinyert 50 dehidroepiandroszteron-alkil-éter tisztítására oszlopkromatográfiás és vékonyréteg-kromatográfiás eljárások egyaránt alkalmazhatók. Vizsgálataink szerint a mikrobiológiai oldallánclebontás eredményeként kapott dehidroepiandroszteron-55 -3-alkil-éterek perklórsav jelenlétében savanhidridekkel reagáltatva dehidroepiandroszteron-3-észterekké alakíthatók át. A vizsgált savanhidridek közül az ecetsavanhidrid alkalmazása bizonyult a legelőnyösebbnek. A dehidroepiandroszteron észterei és a belőlük hidro-60 lízissel előállítható dehidroepiandroszteron számos szintetikus eljárás alapanyagai. A dehidroepiandroszteron-észterek hidrolízisét ismert módon, pl. alkáli-hidroxiddal végezzük. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi 65 kiviteli példákat adjuk meg: 2
