168780. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1alfa-hidroxi-noretiszteron mikrobiológiai előállítására
168780 A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa la-hidroxi-noretiszteron előállítása* Acremonium strictum (MNG 106) törzzsel Acremonium strictum (MNG 106) törzs 3 db egyhetes burgonyás ferdeagaron nőtt tenyészetéből 10—10 ml steril vízzel szuszpenziót készítünk, és ennek 1—1 ml-ével oltunk 25 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett, 100 ml térfogatú, alábbi összetételű táptalajt: 5% malátakivonat 2% pepton 1% szójaliszt 0,5% KH2 P0 4 0,5%MgSO4 .7H 2 O A beoltott lombikokat 24 C°-os termosztát-szobában rázatva (220 fordulat/perc) 2 napig inkubáljuk, majd lombikonként 100—100 mg 2—2 ml dimetilformamidban oldott noretiszteront adagolunk a tenyészethez, és az inkubálást azonos körülmények között 24 órán át folytatjuk. Ezután a fermentleveket egyesítjük és leszűrjük a gomba micéliumának eltávolítása céljából. A szűrletet 2 X 1/3 térfogat etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumokat nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A bepárlási maradékot acetonból kristályosítva 415 mg la-hidroxi-noretiszteront kapunk. Az anyalúg bepárlási maradékát preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk, szilikagél-réteget és 70% etil-acetát: 30% n-heptán összetételű futtató elegyet használva. így további 315 mg la-hidroxi-noretiszteronhoz jutunk. Op.: 208—211 C°. [ot]D —46° (c = 1, metanol). Xmax = 241 nm(e = 16 100). Infravörös színkép (KBr): vmax OH 3420, v( = CH) 3240, vC =0 1650, vC=C 1615 cm"1 . Mágneses magrezonancia spektrum (100,1 MHz, CDC13): 8C 4 - H = 5,9 (1 H, s); 8C,- H = 4,46 (1 H, m, J1;2e =3,8, Jj 2a =3,0, Jj,io = 3,0 Hz); 8C 2e -H =2,72 (I'H, q, J2e 2a ' = - 16,5 Hz); 8C2A - H = 2,52 (1 H, q); SQx - H =2,56 (1 H, s); $C18 - H = 0,92 (3 H, s) ppm. ORD spektrum (c= 0,1%, etanol): [M]344 -4400 (minimum), [M]324 O, [M]290 + 10 000 (inflexió), [M]270 +13 000. Tömegspektrum : a 15 relatív %-nál nagyobb intenzitású ionok tömegszáma (m/e): 314, 296, 270, 247, 215, 213, 187, 160. Molekulasúly: 314 la-hidroxi-ösztr-4-én-3,17-dion előállítása la-hidroxi-noretiszteronból. 300 mg la-hidroxi-noretiszteront 45 ml jégecetben oldunk, és az oldathoz 5 ml vízben oldott 300 mg krómtrioxidot adunk. A reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 150 ml vízre öntjük. A vizes reakciókeveréket 3 X 75 ml kloroformmal extraháljuk. Az egyesített kloroformos extraktumokat vízzel semlegesre mossuk, nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A bepárlási maradékot pre-5 paratív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk, szilikagél-réteget és 85% etil-acetát: 15% n-heptán összetételű futtató elegyet használva. így 114 mg la-hidroxi-ösztr-4-én-3,17-diont kapunk, melyet acetonból kristályosítunk át. 10 Op.:224—227 C° [a]D + 115° (c = 1, kloroform) Xmax =241nm(s = 16 100) Infravörös színkép (KBr): vmax OH 3480, vC=0 1735, 1655, vC=C 1610 cm-1 . Mágneses magrezonan-15 cia spektrum (60 MHz, CDCI3): SC 4 - H = 5,89 (1 H, s); SC!-H=4,45 (1 H, m); 8C18 -H=0,95 (3 H, s) ppm. Tömegspektrum: a 15 relatív %-nál nagyobb intenzitású ionok tömegszá-20 ma (m/e): 288, 273, 244, 126. Molekulasúly: 288 25 50 2. példa la-hidroxi-noretiszteron előállítása Acremonium kiliense (MNG 107) törzzsel Acremonium kilinse (MNG 107) törzs 3 db egyhetes burgonyás ferde-agaron nőtt tenyészetéből 10—10 ml 30 steril vízzel szuszpenziót készítünk, és ennek 1—1 ml-ével oltunk 25 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett, 100 ml térfogatú 1. példa szerinti táptalajt. A beoltott lombikokat 24 C°-os termosztát-szobában rázatva (220 fordulat/perc) 2 napig inkubáljuk. Ezután lom-35 bikonként 20—20 mg 0,5—0,5 ml dimetilformamidban oldott noretiszteront adagolunk a tenyészethez és az inkubálást azonos körülmények között 16 órán át folytatjuk. Ezt követően a fermentlevet egyesítjük és leszűrtük a gomba micéliumának eltávolítása céljából. 40 A szűrletet 2X1/3 térfogat etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített extraktumot nátrium-szulfáton szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A bepárlási maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiás módszerrel tisztítjuk az 1. példában leírt módon. így 110 mg, az 1. pél-45 dában leírt fizikai állandókkal és spektroszkópiai adatokkal rendelkező la-hidroxi-noretiszteront kapunk. Szabadalmi igénypont Eljárás la,17ß-dihidroxi-17a-etinil-ösztr-4-en-3-on mikrobiológiai előállítására, azzal jellemezve, hogy 17ß-hidroxi-17a-etiniI-ösztr-4-én-3-ont Acremonium strictum (MNG 106) vagy Acremonium kiliense (MNG 107) 55 törzzsel aerob körülmények között hidroxilezünk, és az átalakítási terméket a fermentléből elkülönítjük. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 77.3958.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató 4
