168780. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1alfa-hidroxi-noretiszteron mikrobiológiai előállítására
3 168780 4 lajok szénforrásként előnyösen keményítőt, szacharózt, glükózt, glicerint, szójabablisztet, kukoricalekvárt és malátakivonatot tartalmaznak. Különösen előnyösnek találtuk a malátakivonat és a szójababliszt alkalmazását. Nitrogénforrásul a már említett, nitrogént is tartalmazó anyagokon kívül peptont, kazeint és élesztőkivonatot célszerű használni. A táptalajokat szervetlen sókkal egészíthetjük ki. A mikroorganizmusokat süllyesztett, levegőztetett körülmények között 20—30 C° hőmérséklet-tartományban, előnyösen 24 C°-on növesztjük, és ugyanilyen körülményeket választunk az átalakításokhoz is. A fermentáció során a noretiszteron átalakulását a fermentléből vett minták etil-acetátos extraktumának vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával követhetjük nyomon. Az átalakítások befejezése után a gombák micéliumát szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk a fermentléből, majd vízzel nem elegyedő, poláris oldószerrel, célszerűen etil-acetáttal végzett extrakcióval nyerjük ki a terméket. A fermentléből izolált loe-hidroxi-noretiszteron szerkezetét az alábbi vizsgálatokkal igazoltuk. A biooxidációs termék molekulasúlyát 314-nek találtuk a tömegspektrum alapján. Ez arra utal, hogy a fermentáció során egy oxigénatom épült be a noretiszteronba, azaz a biooxidációs termék monohidroxi-noretiszteron. Ezzel a feltételezéssel összhangban a biooxidációs termék infravörös színképében a A4-3-keto-szerkezetre jellemző konjugált ketonsávot (vC = 0 1650 cm-1 ) és szén-szén kettős kötés sávot (vC=C 1615 cm-1 ), valamint a noretiszteron infravörös színképében észleltnél intenzívebb hidroxilsávot (vmax OH 3420 cm-1 ) találtunk. A biooxidációs termék mikrobiológiai úton bevitt hidroxilcsoportja ecetsavanhidriddel piridines közegben szobahőmérsékleten acetilezhető. Ez arra utal, hogy a hidroxilcsoport szekunder jellegű. Sósavas metanol hatására 17oc-etinil-ösztra-l,3,5(10)-trien-3,17ß-diol-3--metiléter keletkezik a biooxidációs termékből. A reakció során a biooxidációs termék A-gyűrűjének aromatizációja a mikrobiológiai úton bevitt hidroxilcsoport kihasadásával jön létre. Az aromatizáció bekövetkezése arra utal, hogy a kihasadó hidroxilcsoport az A-gyűrűben helyezkedik el. A biooxidációs termék tömegspektrumában az m/e 126 tömegszámú töredékionról nagy felbontású méréssel ki lehetett mutatni, hogy C7H 10 O 2 összetételű. Ez a kísérleti adat igazolta, hogy a mikrobiológiailag bevitt hidroxilcsoport vagy az A-gyűrűben, vagy pedig a Q-os szénatomon van. A biooxidációs termék A4-es kettős kötését és etinilcsoportját Pd-katalizátor jelenlétében metanolos közegben hidrogénezve telítettük, így főtermékként a 17ß-hidroxi-17oc-etiI-5ß-ösztran-3-on egy A-gyűrűben hidroxilezett származékához jutottunk. E vegyület optikai rotációs diszperziós görbéje az 5ß,10ß-konfigurációjú szteroidokra jellemző (286 nm középponttal negatív Cotton-effektus; a =—19,2). Ebből a hidrogénezett származékból acetonos közegben sósav hatására 17ß-hidroxi-17oc-etil-5ß-ösztr-l-en-3-on keletkezett az A-gyűrűben levő hidroxilcsoport kihasadásának eredményeként. Az eliminációs termékben a A l-es kettős kötés jelenlétét az alábbi spektroszkópiai adatok igazolják. Az eliminációs termék ultraibolya színképében 231 nm-nél jelentkezik az elnyelési maximum a Al-3-keto-szteroidokra jellemzően; a vegyület infravörös színképében konjugált ketonsávot (vC=0 1660 cm-1) és szén-szén kettős kötés sávot (vC=C 1605 cm-1 ) találtunk; a vegyület mágneses 5 magrezonancia színképében észlelt olefin-protonjelek [§C, -H 7,18 ppm (dd, Jí>2 = 10 Hz, J uo = 5,5 Hz)], 8C2 - H 6,0 ppm [d, Jli2 = Í0 Hz (CDC1 3 )] pedig 5ß-te-Iített Al-3-keto-szerkezetre utalnak [G. Schulz: Tetrahedron Letters 1803 (1967)]. 10 A A l-es kettős kötés kialakulása az elimináció során azt bizonyította, hogy a mikrobiológiai úton bevitt hidroxilcsoport a Cj-es vagy a C2 -es szénatomon helyezkedik el. A biooxidációs terméket ecetsavas közegben króm-15 trioxiddal oxidálva monohidroxi-ösztr-4-én-3,17-dion származékká alakítottuk át. A szakirodalomban beszámoltak már az lß-hidroxi-ösztr-4-en-3,l7-dion előállításáról [C. C. Bolt és munkatársai: Rec. Trav. Chim. 84, 626 (1965)], valamint a 2a-hidroxi- és a 2ß-hidroxi-20 -ösztr-4-én-3,17-dion előállításáról is [H. J. Brodie és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 187, 275 (1969)]. A biooxidációs termékből krómsavas oxidációval előállított monohidroxi-ösztr-4-én-3,17-dion a szakirodalomban ismertetett, C^es illetve C2-es szénatomon 25 hidroxilcsoportot tartalmazó ösztr-4-én-3,17-dion származékokétól eltérő fizikai állandókat és spektroszkópiai adatokat mutatott; ennek alapján feltételezzük, hogy lac-hidroxi-ösztr-4-én-3,17-dion. Ebből viszont az következik, hogy a biooxidációs termék loc-hidroxi-nore-30 tiszteron. E megállapítás helyességét további kísérleti tények is alátámasztják. A biooxidációs termék és a belőle krómsavas oxidációval kapott monohidroxi-ösztr-4-én-3,17-dion L. L. Smith szerint [Steroids 1, 570 (1963)] lúgos közegben 35 felvett ultraibolya színképeiben az l-hidroxi-19-norszteroidokra jellemzően 243 nm-nél és 300 nm-nél jelentkezik elnyelési maximum. A biooxidációs terméknek, valamint a mikrobiológiai úton bevitt hidroxilcsoporton monoacetilezett szár-40 mazékának protonrezonancia spektruma alapján megállapítható, hogy a hidroxilcsoporttal geminális, illetve az acetoxi-csoporttal geminális hidrogénatom egyaránt három vicinális helyzetű protonnal létesít spin-spin kölcsönhatást. Az utóbbiak közül kettő kétségkívül a 45 C2 -es szénatomhoz kapcsolódik. Ezt igazolja az a megfigyelés, hogy a közöttük fellépő geminális spin-spin kapcsolási állandó nagysága J2e , 2a — — 16,5 Hz, ami a C3 -as karbonilcsoport hatására vezethető vissza (N. S. Bhacca, D. H. Williams: Applications of NMR Spec-50 troscopy in Organic Chemistry; Holden-Day Inc., San Francisco, 1964; 57—61. oldalak). A Cres szénatomon levő proton három vicinális kapcsolási állandója mind a biooxidációs termékben, mind annak monoacetátjában a következő értékeket mutatja: J12e = 3,8 Hz, 55 J,2a = 3,0 Hz, J uo = 3,0 Hz. A biooxidációs termék Q-es szénatomon levő konfigurációja egyértelműen megállapítható a biooxidációs termékből hidrogénezés útján előállított, a Cr es szénatomon hidroxilcsoportot tartalmazó 17ß-hidroxi-17a-60 -etiI-5ß-ösztran-3-on származék protonrezonancia spektruma alapján. A Cj—H proton kémiai eltolódása [8(CDCI3) 4,06 ppm] ekvatoriális helyzetű hidroxilcsoportra utal. Ugyanezen hidrogén vicinális kapcsolási állandóinak összege 21,4 Hz, ami — kettős rezonancia 65 kísérletek tanúsága szerint — J12e + Jl2a = 17,6 Hz és 2
