168778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin-tipusú antibiotikumok előállítására
17 168778 18 Példa 1. lépés: fermentáció A Micromonospora purpurea var. nigrescens X—148 törzs mélyhűtve tárolt (—15 C°) vegetatív micéliumának 1 ml-ével (élő csíraszám: 106—10 7 /ml) steril körülmények között 2000 ml-es Erlenmeyer-Iombikban levő 800 ml steril táptalajt. oltunk be, melynek összetétele a következő: '.. oxoid húskivonat 3g Pepton lg szacharóz lg oldható keményítő 24 g kalciumkarbonát 4g csapvíz 1000 mire Az elegy pH-ját a sterilezés előtt 7,0-ra állítjuk. A tenyészetet síkrázógépen (320 fordulat/perc, 3,7 cm kilengés) 37 C°-on 3 napig inkubáljuk. Az így kapott tenyészettel steril körülmények között 3 m3 -es fermentorban levő 2000 liter steril táptalajt oltunk be, melynek öszszetétele a következő: II. burgonyakeményítő kristálycukor élesztőkivonat kazein-hidrolizátum pepton kukoricalekvár kalciumkarbonát pálmaolaj csapvíz 10 g 5g 5 ml (10%-os oldat) 20 ml (20%-os oldat) 2g 1 g (50% szárazanyagtartalom) 4g 2ml 1000 ml-re A táptalaj pH-ját a sterilezés előtt 7,0-ra állítjuk. A tenyésztést keverés és levegőztetés közben 50—60 órán át folytatjuk. A tenyésztés hőfoka 35 C°, a keverés 180 fordulat/perc, a levegőztetés 1/1 v/v. A beérett inokulumot használjuk fel a 20 m3 termelő fermentáció táptalajának oltásához. A termelő fermentáció táptalajának összetétele a következő: szójaliszt 30 g burgonyakeményítő 15 g glicerin 15 ml kalciumkarbonát 5g kobaltklorid (CoCl2 .6 H 2 0) 2 mg "> a pdimdOltt) csapvíz z g 1000 ml-re A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0-ra állítjuk. A sterilezést keverés közben 121 C°-on, 1,3—1,4 atm nyomáson végezzük 1 órán keresztül. A tenyésztést saválló acél fermentorban végezzük. A keverő fordulatszáma 130/perc, a levegőztetés 1/1 v/v. Az antibiotikum-termelés a fermentáció 35—40. órájában indul meg, és a maximális értéket a 100—110. órában éri el. A fermentlé összes antibiotikum-tartalma gentamicin-C standardra vonatkoztatva 850 E/ml (1 E megfelel 1 gamma gentamicin-C standard (Cji 32%, C2 : 48%, Cla : 20%) hatékonyságának Staphylococcus epidermidis tesztorganizmuson, agardiffúziós módszerrel meghatározva). A termelt antibiotikumok összes mennyisége 1000—1050 gamma/ml, melynek 75%-a gentamicin-C. A gentamicin-C frakció összetétele: C1 : 36%, C2 : 45%, Cla : 19%. 2. lépés: a nyers antibiotikum komplex izolálása 5 Az 1. lépés szerint előállított 1000 liter erjesztéses oldathoz (850 E/ml) keverés közben annyi 5 n kénsavat adunk 20 C°-on, hogy az elegy pH-ja 2,0 legyen. Az elegyet megszűrjük, és a micéliumot 100 liter csapvízzel átmosva 920 liter szűrletet kapunk. A szűrlethez 2,7 kg 10 szilárd oxálsavat adunk, majd keverés közben az oldat pH-ját 5 n nátriumhidroxid adagolásával 7,5-re állítjuk be. Az elegyet 10 percig tartó 80—90 C°-os hőkezelés után melegen megszűrjük, és a csapadékot 50 liter vízzel átmossuk. A 20 C°-ra lehűtütt 980 liter (825 E/ml) 15 szűrletet három oszlopból álló, sorbakapcsolt, egyenként 3—3 liternátriumformájú(Wofatit CP—300) gyantát tartalmazó oszloprendszeren (oszlopátmérő 8 cm, gyantarétegmagasság 60 cm) folyatjuk át 50 liter/óra sebességgel. Az átfolyatás befejezésekor az első oszlop gyakorlatilag 20 telítődik, vagyis az ezen az oszlopon átfolyó oldat kb. 800 E/ml hatóanyagot tartalmaz. Az erjesztéses oldatban levő antibiotikumok mennyiségének mintegy 15%-a a második oszlopon kötődik meg. A második oszlopról elfolyó oldat a megkötés befejezésekor mintegy 5—10 25 E/ml hatóanyagot tartalmaz. Ezt az oszlopot a gentamicin teljes kinyerése érdekében folyamatos üzemmenet esetén további friss antibiotikum-tartalmú oldattal telítjük. Az első gyantaágyat 25 liter desztillált vízzel átmossuk, 30 majd az antibiotikumokat 0,5 liter/óra sebességgel 4,0 n kénsavval oldjuk le. Az antibiotikum-tartalmú oldatokat, melyek hatékonysága 5000 E/ml-nél nagyobb, egyesítjük. Ily módon 4500 ml 136 000 E/ml aktivitású oldatot kapunk. (Amennyiben nem folyamatosan dol-35 gozunk, a 2. oszlopról hasonló módon 3500 ml 40 000 E/ml-es, a 3. oszlopról pedig 2600 ml 15 000 E/ml aktivitású oldatot kapunk.) A sötétbarna színű, erősen savanyú eluátum pH-ját trietilaminnal keverés közben 4,5-re állítjuk be, majd az 40 oldathoz annyi metanolt (kb. 2500 ml) adunk, hogy a keletkező zavarosodás még éppen eltűnjön. Az elegyhez 80 g aktívszenet (Norit A) adunk és 30 percig keverjük, majd megszűrjük. A szenet 2 X 200 ml desztillált vízzel átmosva, 6900 ml 83 000 E/ml aktivitású oldatot ka-45 punk. Ezt az oldatot állandó keverés közben 35 liter metanolba öntjük. Ülepedés után a kivált nyers antibiotikum-elegyet leszűrjük, 2X2 liter metanollal átmossuk, majd vákuumban 30—40 C°-on súlyállandóságig szárítjuk, így 962 g nyers antibiotikum komplexet kapunk 50 szulfátsó formájában. Biológiai aktivitása 536 E/mg; hamutartalma 2,0%; optikai forgatóképessége: (a)D 25 = +104° (1%, víz). 3. lépés: a gentamicin -A, -B, -Bv -X sziszomicin elválasztása 55 500 g, a 2. lépés szerint kapott nyers antibiotikum szulfátsó elegyet (gentamicin komplex) feloldunk 2 liter desztillált vízben. Az oldat pH-ját koncentrált amnioniumhidroxiddal 7,8-ra állítjuk be, majd 25 g aktívszén hozzáadása és 30 perces keverés után az elegyet megszűr-60 jük. A szűrletet 1 db 10 liter Amberlite CG—50—II (NHJ) gyantát tartalmazó kromatografáló oszlopra visszük (oszlopátmérő 12 cm, gyantarétegmagasság 88 cm (a továbbiakban 0 ill. h)], és 30 liter desztillált vízzel mossuk (az effluens elszíntelenedéséig). A megkö-65 tött gentamicin-típusú antibiotikumok leoldását ezután 9
