168778. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin-tipusú antibiotikumok előállítására
168778 7 8 A fenti lényegesebb eltérő sajátságok alapján az X— 148 jelzésű törzs határozottan megkülönböztethető a gentamicineket, ill. gentamicin-típusú antibiotikumokat termelő alábbi Micromonospora, ill. Streptomyces fajoktól, ill. változatoktól: Micromonospora purpurea NRRL-2953, Micromonospora purpurea var. violacea 55-5829 Micromonospora echinospora NRRL-2985, Micromonospora echinospora var. ferruginea NRRL-2995, Micromonospora echinospora var. pallida NRRL-2996 Micromonospora grisea NRRL—3800, Micronospora rhodorangea NRRL—5326, Micromonospora inoyaensis NRRL—3292, Streptomyces longisporoflavus S—244. Az X—148 jelzésű új mikroorganizmus törzset a fentiek alapján Micromonospora purpurea var. nigrescens nov. var.-nak neveztük el. A fenti törzset 1973. december 12-én letétbe helyeztük 00122 sz. alatt az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében. A Micromonospora purpurea var. nigrescens törzs tenyésztésére a sugárgombák tenyésztésére általánosan szokásos módszereket alkalmaztunk. A tenyésztést legelőnyösebben süllyesztett kultúrában végezhetjük. Az antibiotikumok termelésére szolgáló táptalajban a sugárgomba által asszimilálható különféle szén- és nitrogénforrások, szervetlen sók, nyomelemek és esetleg egyéb járulékos anyagok (biosz-anyagok, habzásgátlók) lehetnek jelen. Szén- ill. nitrogénforrásként, ill. energiaforrásként alkalmazhatunk szójalisztet, bablisztet, kazeinhidrolizátumot, élesztőkivonatot és különféle szénhidrátokat, mint amilyen a glükóz, keményítő, oldható keményítő, szacharóz, glicerin, laktóz stb. Szervetlen sóként alkalmazhatunk nátriumnitrátot, ammóniumnitrátot, ammóniumszulfátot, ammóniumkloridot, illetve különféle Fe3+, Mg 2 +, Co 2 +, Ni 2 +, Zn 2 +, Mn 2 + és Cu2+ sókat. A táptalaj puíferkapacitásának növelésére előnyösen kalciumkarbonátot alkalmazhatunk. Habzásgátlóként általában növényi olajokat (pálma- és napraforgóolaj), ill. szilikon-alapú habzásgátlókat alkalmazhatunk. Igen fontos, hogy a táptalajban az egyes alkotórészek a termelő törzs tulajdonságainak megfelelő arányban forduljanak elő. A különféle táptalajkomponensek felhasználása többféle tápközeg előállítást is lehetővé tesz. A rázott kultúra és az inokulum fermentáció tápanyagigénye némiképpen eltér a főfermentációétól. A gentamicin antibiotikumok termelésére a legelőnyösebbnek a szójalisztet, burgonyakeményítőt, glicerint, kalciumkarbonátot, kobaltkloridot és pálmaolajat tartalmazó tápközeg bizonyult. A fermentáció hőfoka 25—40 C° között változhat; legelőnyösebbnek a 28—33 C°-on végzett fermentáció bizonyult. A keverés fordulatszáma a fermentor geometriájának függvényében percenként 100 és 250 között változhat. A levegőztetés előnyösen 1/1 v/v percenként. A fermentáció során keletkező antibiotikumok öszszes hatékonyságát Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal állapítjuk meg agardiffúziós módszerrel, gentamicin-C standard anyagra vonatkoztatva (Federal Register J6_ 119. szám 11811. (1971)]. A gentamicin-C komponensek mennyiségét az irodalomban ismertetett 5 [J. Pharm Sei. 57\ 1319., 2170. (1968)] módszerrel, papírkromatográfiás elválasztás után biológiai úton határozzuk meg. Az egyéb komponenseket mikrobiológiai úton (különféle tesztorganizmusok, Bacillus subtilis, Mycobacterium pellegrino) vagy kémiai módsze-10 rekkel (ninhidrin színreakció) határozzuk meg. A 90—110 órás fermentációs idő alatt a fermentlé ossz. aktivitása kb. 800—900 E/ml-t ér el (1 E = 1 gamma/ml gentamicin-C hatékonyság) gentamicin-C 15 standardra vonatkoztatva. A fermentleben jelenlevő antibiotikumoknak mintegy 60—80%-át teszik ki a gentamicin-C komponensek. Arányuk, mely kismértékben függ a fermentáció körülményeitől (hőfok, táptalaj, idő, levegőztetés stb.): 15—40% C„ 30—70% C2, 12—45% 20 C„. Az egyes antibiotikumok mennyisége: 5—10% gentamicin-A, 2—5% gentamicin-B1( 2—5% gentamicin-B, 0,5—1% gentamicin-X, 3—6% sziszomicin. 25 Vizsgálataink során olyan új módszert dolgoztunk ki, mely lehetővé teszi e nagyszámú antibiotikum egyszerű és gazdaságos elválasztását, ami által elérhető, hogy egyetlen fermentáció során előállított több, igen jelentős kemoterápiás hatással rendelkező antibiotikumot gaz-30 daságosan használhassunk fel. A találmány tárgyát képező eljárásban a Micromonospora purpurea var. nigrescens törzs által termelt antibiotikumok közül a gentamicin-C komplex és az 35 egyes gentamicin-C komponensek kinyerését vagy ismert módon, vagy pedig a 167 121 Isz. szabadalmi leírásban ismertetett új módszerekkel oldhatjuk meg. A további antibiotikumok közül a gentamicin-A, -B, 40 -Bj és -X kinyerésére szolgáló ismert módszerek közül a 71/4013 sz. dél-afrikai szabadalmi leírásban ismertetett eljárás a szokásos ioncserélős technológiával (3 091 572 sz. amerikai szabadalmi leírás) kapott nyers gentamicinből indul ki. Első lépésként a nyers gentamicint Amber-45 lite IRA—401—S gyantán színtelenítik, majd Dowex— 1X2 gyantaoszlopon ionmentes vízzel végzett szelektív leoldással részlegesen elkülönítik a gentamicin-C komponenseket a fenti 4 antibiotikumtól. Ezután a kapott, főként gentamicin-A-ból, -B-ből, -B1-ből, -X-ből és még 50 jelentős mennyiségű gentamicin-C-ből álló elegyből a gentamicin-A fő tömegét metanolban oldhatatlan karbonátsója alakjában elkülönítik. A visszamaradó elegyet sorbakapcsolt szilikagél-oszlopokon metanol: kloroform : 25%-os ammóniumhidroxid 1:1:1 arányú ele-55 gyének alsó fázisával végzett kromatográfiával választják el, és így nyerik a tiszta B, Bj és X komponenseket. Az elválasztás hatásfoka igen rossz, az egyes komponenseknek csak töredék mennyiségét kapják meg tiszta állapotban. 750 g kiindulási anyagból összesen 140 g 60 (18,8%) tiszta hatóanyagot kapnak. A 787 758 sz. belga szabadalmi leírás szerint a Micromonospora grisea ill. Micromonospora rhodorangea tenyésztésével előállított antibiotikumok (G—418, gen-65 tamicin-A, sziszomicin, verdamicin-I) előállítását és 4
