168735. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-glutamil-p-nitroanilid-szárm előállítására és gamma-glutamiltranszpeptidaz aktivitásának meghatározására
168735 A percenkénti extinkciókülönbségekből (AE/min) középértéket képezünk és ezeket az egyenletbe behelyettesítjük. B) Számítás: Egy nemzetközi egység (U) az az enzimaktivitás, amely 25 C°-on 1 ;j.mól szubsztrátot 1 perc alatt átalakít. Az értékeket 1 ml testfolyadékra, például szérumra vonatkoztatjuk. A ml-enkénti enzimaktivitás (A) a következő egyenlet alapján számítható ki: A = V • 1000 min • s • d • v AE[mU/ml] A 3-karboxi-4-nitroanilin extinkciós koefficiense (e) a vizsgálati körülményeink között 405 mm-en 9,4 cm2 /fjimól. A küvettahossz (d) 1 cm, v a szérum térfogata (0,2 ml), V az össztérfogat (3,2 ml). Az extinkciót 1 percenként mérjük. Ebből következik, hogy A =E(405 nm)/min X 1702[mU/ml]. 3. példa 5-(Y-Glutamil-amino)-2-nitro-benzolszulfolsav (GLUPA-3-szulfonsav előállítása 115 g 2-nitro-5-amino-benzolszulfonsavat és 150 g ftaloil-glutaminsav-anhidridet 2 ml abszolút dimetilformamidban szuszpendálunk és ezután olajfürdőn 145 C°-ra melegítjük. A 145 C° elérése után a keveréket 1 órán keresztül ezen a hőmérsékleten tartjuk, majd lehűtjük. A reakciókeveréket szűrjük és a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. Az olajos maradékot metanolban oldjuk és 80%-os hidrazinhidráttá a pH-t 9-re állítjuk. 24 óra múlva a keletkezett kristályokat kiszűrjük, kevés metanollal mossuk és eldobjuk. A szűrletet szárazra pároljuk és mélyhűtött acetont adunk hozzá óvatosan, hűtés mellett. A kivált csapadékot leszívatjuk, acetonnal jól kimossuk és a maradékot vízben keverés közben oldjuk. A vízben oldhatatlan maradékot kiszűrjük és a szűrletet ammóniával pH = = 7,5-re állítjuk, majd bepároljuk. Aceton hozzáadására kikristályosodik az 5-(y-glutamil-amino)-2-nitro-benzolszulfonsav ammóniumsója. A termék világossárga druzák alakjában igen jól kristályosodik. Op.: 186—187 C°. A spektrum adszorpciós maximuma 290 nm-nél van. e = 4,57 (cm2 /fj.mól). Kitermelés kb. 115—120 g, további 15—20 g kapható még a kristályosítási anyalúgból. Összes kitermelés kb. 135 g, az elméletileg számított érték 70%-a. A vegyület szobahőmérsékleten jól oldódik és a y-glutamil-p-nitroanilid átalakulási hányadának körülbelül 160%-át éri el azonos körülmények között. 4. példa A y-GT meghatározása GLUPA-3-szulfonsavval A fenti vegyület enzimatikus hasításánál 5-amino-2--nitro-benzolszulfonsav szabadul fel. E vegyület ultraibolya spektrumának jellemzői a következők: X = 380 nm e = 5,45 (cm2 /jxmól) 405 nm-en e = 7,38 (cm2 /[i.mól) 380 nm-en. A) A mérés elvégzése: Oldatok: 0,1 mólos trisz-pufferoldat: (mely glicilglicinre 150 mmólos) 5 12,1 g trisz-pufferanyagot és 19,82 g glicilglicint 900 ml kétszer desztillált vízben oldunk és 1 n sósav-oldattal 8,50 pH-értékre állítjuk be, majd kétszer desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel. Szubsztrát-oldat: 10 4,97 g GLUPA-3-szulfonsavat (monoammóniumsóként, 1 molekula kristályvízzel számítva), molekulasúly 382,3) 100 ml fenti trisz-pufferben oldunk, 2,8 ml 0,1 mólos trisz-pufferoldatot és 0,2 ml szubsztrát-oldatot küvettában pipettázunk, az oldatokat 15 25 C°-ra temperáljuk, majd megkezdjük a vizsgálatot 0,2 ml humánszérum hozzáadásával. Összekeverés után leolvassuk az extinkciót 405 nm-nél, egyidejűleg megindítjuk a stopperórát. Pontosan 1, 2 és 3 perc múlva megismételjük az extinkció leolvasását. 20 A vizsgálatnál a végkoncentrációk a következők: Trisz-puffer = 93,8 mmól glicilglicin = 140,6 mmól GLUPA-3-szuIfonsav =8,1 mmól. 0,2 ml humánszérum 25 B) Számítás Egy nemzetközi egység (U) az az enzimaktivitás, amely 25 C°-on 1 p,mól szubsztrátot 1 perc alatt átalakít. Az értékeket 1 ml testfolyadékra, például szérumra vonatkoztatjuk. A ml-enkénti enzimaktivitás (A) 30 a következő egyenlet alapján számítható ki: A = V1000 min • s • d • v • AE [mU/ml] Az 5-amino-2-nitro-benzolszulfonsav extinkciós koef-35 ficiense (e) a vizsgálati körülményeink között 405 nm-en 5,45 cm2 /[jimól. A küvettahossz (d) 1 cm, v a szérum térfogata (0,2 ml), V az össztérfogat (3,2 ml). Az extinkció mérését percenként végezzük. Ebből következik, hogy 40 A = AE(405 nm)/min X 2936 [mU/ml]. Szabadalmi igénypontok 45 1. Eljárás az (I) általános képletű vegyület — ahol R jelentése a (II) képletű y-glutamil-csoport és X jelentése karboxilcsoport-, és ennek sói, célszerűen ammóniumsója előállítására, azzal jellemezve, hogy glutaminsav-anhidridet, amelynek aminocsoport-50 ján ftaloil-védőcsoport van, poláros oldószerben egy (VII) általános képletű vegyülettel, ahol X jelentése a fenti, reagáltatunk és a képződött glutaminsav-p-nitroanilid-származék védőcsoportját előnyösen hidrazinnal lehasítjuk, és a kapott vegyületet kívánt esetben 55 sóvá alakítjuk át. (Elsőbbsége: 1972. december 5.) 2. Eljárás a y-glutamiltranszpeptidáz-aktivitás meghatározására, glicilglicin alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként az (I) általános képletű 60 vegyületet, amelyben R a II képletű y-glutamilcsoportot és X a karboxilcsoportot jelenti vagy ennek sóit, célszerűen ammóniumsóját alkalmazzuk és a képződött 5-amino-2-nitro-benzoesav mennyiségét meghatározzuk. 65 (Elsőbbsége: 1972. december 5.) 4
