168696. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új noapeptidamid-származékok előállítására
19 168696 20 méket feloldjuk 0,1 n vizes ecetsav oldatban és az oldatot átbocsátjuk Sephadex LH-20 gyantával töltött oszlopon. Az oszlopról távozó oldatot liofilizálva, 0,043 súlyrész mennyiségű tiszta terméket kapunk. Rf 3 = 0,41; [«g = _ 59,4° (c = 0,5, 5%-os ecetsavban). Aminosavelemzés: His 1,1 (1); Arg 1,1 (1); Trp 0,87 (1); etilamin 1,0 (1); Ser 0,81 (1); GIu 1,03 (1); Pro 1,0 (1); Gly 1,0 (1); ILe 1,06 (1); Phe 0,97 (1). 8. példa H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC2H 5 előállítása a) BOC-Met-Arg-Pro-NHC2 H 5 készítése 1,91 súlyrész Z-Arg(N02 )-Pro-NHC 2 H 5 -öt feloldunk 10 térfogatrész 25%-os HBr-ecetsavelegyben. Az oldatot 30 percig állni hagyjuk, majd vízmentes étert adunk hozzá. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel gondosan mossuk. Szárítás után megkapjuk a kondenzáció amin-összetevőjet. Párhuzamosan, 1,75 súlyrész BOC-Met-OH • DCHA-t feloldunk 100 térfogatrész éterben. Az oldatot kétszer mossuk egyenként 50 térfogatrész 0,2 n vizes kénsavoldattal, majd vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk. Az étert elpároljuk, a maradékot pedig feloldjuk 20 térfogatrész dioxánban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük és a hideg oldathoz hozzáadunk 0,905 súlyrész DCC-t és 0,79 súlyrész HONBI-t. A keveréket 2 órán át keverjük. A keletkezett DC-karbamidot szűréssel eltávolítjuk és a szűrletet bepároljuk. A maradékhoz 5 térfogatrész DMF-et adunk és hozzáadjuk a fenti úton készített amin-összetevő teljes mennyiségét. A kapott oldatot hűtjük, majd hozzáadunk 1,12 térfogatrész trietilamint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük, majd a DMF-et elpároljuk. A maradékot feloldjuk 100 térfogatrész kloroformban, az oldatot 0,1 n sósavval, nátriumhidrogénkarbonát 5%-os vizes oldatával és vízzel mossuk, vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk és a kloroform elpárolásával töményítjük. A maradékhoz étert adva szilárd anyag válik ki. Ezt a szilárd anyagot etilacetát-éter elegyből átkristályosítva, 1,4 súlyrész mennyiségű BOC-Met-Arg-Pro-NHC2 H 5 -öt kapunk, op.: 101—104 °C (boml.); [a&2 = -64,4° (c-1,0, metanolban). Elemzés a C23 H 4 20 7 N 8 S • 1/2 H z O képlet alapján: számított: C =47,33, H =7,42, N = 19,20, S =5,49 talált: C = 47,67, H = 7,23, N = 18,94, S = 5,48 b) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC2H 5 készítése 0,275 súlyrész BOC-Met-Arg(N02 )-Pro-NHC 2 H 5 -öt feloldunk 0,1 térfogatrész 2-merkapto-etanoI és 5 térfogatrész trifluorecetsav elegyében és az oldatot 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az elegyhez ezután 0,085 térfogatrész 5,7 n sósavat adunk. A kapott keveréket lehűtjük és 50 térfogatrész étert adunk hozzá. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk, DMF-ben oldjuk és az oldatot 0 °C-ra hűtjük. Hozzáadunk 0,318 súlyrész H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hidrokloridot, 0,107 súlyrész HONBI-t, 0,124 súlyrész DCC-t és 0,17 térfogatrész N-etil-morfolint és a reakcióelegyet 12 órán át keverjük. A csapadékként kivált DC-karbamidot szűréssel eltávolítjuk és a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 5 térfogatrész 5%-os vizes etanolban. Ezt az oldatot Amberlite XAD-2 gyantából készült oszlopra visszük, amelyről 5%-os vizes etanol 5 80%-os vizes etanol lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk. A főfrakciókat liofilizálva és szárítva, 0,135 súlyrész H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Try-Gly-Met-Arg(N02)-Pro-NHC2H 5 -öt kapunk. Ebből a termékből 0,1 súlyrészt feloldunk 0,02 térfogatrész anizol, 0,02 térfogatrész 10 etanol, 0,02 térfogatrész 2-merkapto-etanol és 6 térfogatrész hidrogénfluorid elegyében és az oldatot 0 °C-on 1 órán át keverjük. A hidrogénfluoridot csökkentett nyomáson elpároljuk és a maradékot szárítószekrényben szárítjuk. A megszárított maradékot feloldjuk 20 tér-15 fogatrész vízben és az így kapott oldatot átbocsátjuk Amberlite CG-400 (acetát-ciklus) gyantából készült oszlopon. Az oszlopról távozó oldatot liofilizáljuk. A maradékot feloldjuk 20 térfogatrész vízben és az oldathoz hozzáadunk 0,4 térfogatrész tioglikolsavat. A rendszert 20 60 °C-on 10 órán át állni hagyjuk. A reakciókeveréket ezután 50 térfogatrész vízzel hígítjuk és az oldatot karboximetilcellulóz oszlopra öntjük fel, amelyről 0,005 n ammóniumacetát-0,2 n ammónium-acetát lineáris gradiensű rendszerrel eluáljuk. A kívánt terméket 25 tartalmazó főfrakciókat liofilizálva, 0,02 súlyrész menynyiségű nyersterméket kapunk. Ezt a nyersterméket Sephadex LH-20 gyantából készült oszlopon adszorbeáljuk, amelyről 0,1 n ecetsavval oldjuk le. Az így kapott oldatot liofilizálva kapjuk meg a tisztított terméket. 30 TLC: Rf = 0,31 (szilikagél; n-butanol-ecetsav-etilacetát-víz 1: 1: 1: 1); [x]%= -43,2° (c=0,25, 5%-os ecetsavban). Aminosavelemzés: His 0,9 (1); Trp 0,8 (1); Ser 0,7 (1); Glu 0,9 (1); Pro 1,1 (1); Gly 1,0 (1); Met 0,9 (1); Tyr 0,7 35 (1); etil-amin 0,9 (1). A terméket minimális mennyiségű 5%-os ecetsavban oldva és liofilizálva az acetátot kapjuk; [a]" = -43,0° (c = 0,25, 5%-os ecetsavban). Kísérlet 40 A találmány szerinti eljárással előállított nonapeptid amidszármazékokat szubkután adtuk diösztruszban levő patkányoknak és meghatároztuk peteérést kiváltó hatásukat. 45 Táblázat Peteérést kiváltó hatás diösztruszban levő patkányoknál ED50 (ng/100 g A8 testsúly) Tyr Leu -NHCH3 165,0 Tyr Leu -NHC2 H 5 32,0 Tyr Leu -NH—C2 H 5 —H 3 56,0 Tyr Leu -NHC2 H 4 OH 170,0 Tyr Leu -NHC2 H(CH 3 ) 2 76,0 Tyr Nie -NHC2 H 5 53,6 Tyr Met -NHC2 H 5 35,0 Phe Leu -NHC2 H 5 84,0 Phe He -NHC2 H 5 115,0 Tyr t Leu ermészetes Gly—NH2 dekapeptid 215 ± 12 ng 10
