168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben
17 168378 18 tum hőmérsékletét gyorsan 75 C°-ra emeljük és ezen a hőmérsékleten tartjuk 15 percen át, előnyösen nitrogénatmoszférában. Ezután az eluátumot jeges fürdőben 10 °C alá hűtjük, a képződött nagy mennyiségű csapadékot elkülönítjük, és a szűrletet ionmentes 5 vízzel szemben dializáljuk, 180 mg szacharóz oldása útján stabilizáljuk, majd mikropórusos (pórusméret 0,22 mikron) szűrőn végzett szűrés útján sterilizáljuk, steril ampullákba töltjük, és az így kapott steril oldatot liofilizáljuk. így tiszta orgotein állítható elő. 10 Az 1. példában ismertetett módon előállított orgotein tisztítható utólagosan karboximetil-cellulózzal töltött oszlopon is. 11 ml-es CMC-oszlopot készítünk, és 5,3 pH-értékű, 0,01 mólos nátrium-acetát-oldattal kiegyensúlyozzuk. A DEAE-cellulózzal 15 tisztított orgoteinből 40 mg-ot feloldunk a pH 5,3 értékű, 0,01 mólos acetát-pufferben, és ugyanezen puffer néhány adagjával szemben dializáljuk. Az oldhatatlan anyagot adott esetben centrifugálás útján elkülönítjük, és a kapott tiszta felülúszó fázist a 20 CMC-oszlop tetejére rétegezzük. Az átfolyási sebesség mintegy 12 ml/óra. Az oszlopot 30 ml 5,3 pH-értékű, 0,01 mólos acetát-pufferrel mossuk a nem adszorbeálódott fehérjék eluálására. Az eluálást ezután folytatjuk összesen 200 ml térfogatú, 0,01 móltól 0,1 25 mólig egyenesen növekvő molaritású, 5,3 pH-értékű acetát-pufferrel. Igen tiszta orgotein eluálódik 0,018 mól és 0,028 mól ionerősség között, majd az orgotein a fentiekben ismertetett módon az eluátumból elkülöníthető. 30 4. példa Orgotein elkülönítése szarvasmarha véréből 870 ml friss szarvasmarha vért összekeverünk 3,8%-os nátrium-citrát oldattal 0,5 v/v arányban. A 35 kapott elegyet 0 C°-on 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, majd a plazmát elöntjük, és az ép vörös vérsejteket (PRC) háromszor 0,9%-os fiziológiás sóoldattal mossuk. Ezt követően a vörös vérsejteket (PRC) 5 percen át végzett ultrahangos kezeléssel 40 (Biosonik III típusú készülék 70. beállításában) elroncsoljuk, madj először desztillált vízzel, ezt követően pH 6,0.értékű, 0,005 mólos foszfát-pufferrel szemben dializálunk 4 C°-on 24 órán át (négyszer 4 literes adagokban). A térfogatnövekedés mintegy 110%-os. 45 Az így kapott dializáit extraktumot 2,5 cm X 30 cm méretű (üres térfogata 147 ml), DEAE-cellulózzal (szálas DEAE-23, Reeve-Angel) töltött oszlopba töltjük, melyet előzetesen 6,0 pH-értékű, 0,005 mólos foszfát-pufferrel kiegyensúlyoztunk. Az oszló- 50 pot ezt követően 240 ml/óra átfolyási sebesség mellett 0,005 mólos foszfát-pufferrel eluáljuk. A hemoglobin legnagyobb része megjelenik az átöblítési térfogatnak megfelelő eluátumban, míg a maradék hemoglobin további 230 ml-el eluálható (összesen 55 450 ml eluálószer). Az orgotein eluálását ugyanezen puffer 4 liternyi mennyiségével végezzük, amikor is a puffer nátrium-klorid koncentrációját 0-ról 0,08 mólra növeljük. Az eluátum réz- és cinktartalmát, valamint az A26s és A 280 abszorpciókat a fentiekben ismerte- 60 tett módon mérjük. Három finom szerkezetű csúcs észlelhető az eluátum térfogatának 575., 750 és 1425. milliliterjénél. Az orgotein (második csúcs) az eluátum azon frakciójában jelenik meg, ahol az A265/A280 abszorpcio-arány értéke 1,27 valamint a 65 réz- és cinktartalom maximális. Az eluátum 750 ml és 1030 ml közötti frakciója (0,025—0,035 mólos ionerősség) tartalmazza az igen tiszta orgotein túlnyomó részét. Az eluálás lefutását az 1. ábra mutatja be, amelyen az eluátum réz- és cinktartalmát, valamint az A26 s és A28 o abszorpciókat ábrázoljuk. Mint az 1. ábrából látható, a réz- és a cinktartalom a 60. mintavevő csövecskénél kezd el meredeken nőni. A 70. mintavevő csövecskénél az A265 abszorpció nőni kezd, és körülbelül a 80. csövecskénél meghaladja az A28 o abszorpciót. Az eluátumnak ez a frakciója igen tiszta orgoteint tartalmaz. Az eluátum szennyeződéstartalma ezután nőni kezd, mint az az A265 és A 280 abszorpciók növekedéséből, és a réz-, valamint cinktartalom egyidejű csökkenéséből látható. A 70-92. mintavevő csövecskék tartalmát összegyűjtjük, és az orgoteint elkülönítjük. Az orgoteint tartalmazó frakciót ionmentes vízzel szemben addig dializáljuk, míg vezetőképessége mintegy 0,3-0,45 p mho lesz, majd a dializáit frakciót 0,45 mikronos szűrőn keresztül szűrjük, és liofilizáljuk, Mintegy 52 mg orgoteint kapunk a termelési hányad 0,013%, az ép vörös vérsejtekre vonatkoztatva, míg a peroxid-diszmutáz alktivitás 2500 egység/mg, mely közel 75%-át jelenti az elroncsolt vörös vérsejtek eredeti összes peroxid-diszmutáz aktivitásának, mint az meghatározó McCord és Fridovich által ismertetett módon [J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969)]. Az oszlop regenerálható újbóli felhasználás céljára legalább 0,1 mól és legfeljebb 2 mól ionerősségű pufferrel végzett mosás és ionmentes vízzel végzett öblítés útján. A 4. példában ismertetett módon lényegében tiszta orgotein különíthető el emberi, nyúl-, patkány- és tyúkvér vörös vérsejtjeiből. A 4. példában ismertetett módon eljárva hasonló eredményeket kapunk TEAE-cellulózt és dietil-amino-etil-csoportokat tartalmazó térhálósított dextrán gyantát (DEAE-Sephadex) használva. 5. példa A 4. példában ismertetett módon járunk el, azonban a hemoglobintól mentes oszlopból a könnyen eluálható fehérjéket mintegy 500 ml, nátrium-klorid adagolása útján 0,02 mól ionerősségre beállított 0,005 mólos foszfát-pufferrel, az orgoteint ugyanezen puffer nátrium-kloriddal 0,035 mól ionerősségre beállított mintegy 1000 ml-jével eluáljuk. Az orgoteint tartalmazó frakciót ott választjuk el az eluátumból, ahol az A265 /A 2g0 abszorpció-arány mintegy 1 vagy egynél nagyobb, míg a réz- és cinktartalom maximális. Az oszlopot nátrium-klorid adagolása útján 0,1 mól ionerősségre beállított a fentiekben használt foszfátpuffer 1000 ml-jével tisztítjuk. 6. példa Orgotein emberi vérből 2 egység ACD [citromsav, nátrium-citrát és glükóz keveréke] koagulálásgátlóval kezelt, tárolt emberi vért (1 egység = 450 ml vér 67,5 ml ACD koagulálásgátlóban; az ACD 100 ml-je 2,45 g dextrózt, 0,80 g citromsavat és 2,2 g nátrium-citrátot tartalmaz, az utóbbit vizet tartalmazó formában számolva) centri-9
