168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben
11 168378 12 csökken. Az A2 8o és A 2 65 abszorpció 0,025 mól esetén éles növekedést mutat, egyidejűleg az A265/A280 arány közel van a maximumhoz vagy éppen a maximális. Ezt követően az abszorpció folyamatosan csökken, majd mintegy 0,034 mól esetén ismét nőni kezd. Tiszta orgotein állítható elő, ha a 3 579 494 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon DEAE-cellulózzal előzetesen tisztított orgoteint hőkezelésnek vetünk alá. A fentiekben ismertetett módon másodszori ioncserélő kromatográfiás tisztítás is végezhető. A találmány szerinti eljárás egy másik változata szerint egy nagy, azaz 0,5—5 ml/ml ép vörös vérsejt arányú, nagy átfolyási sebességű oszlop használható hemoglobint elkülönítő oszlopként az elroncsolt és dializáit, plazmától megszabadított vörös vérsejtek oldható fehérjéinek feldolgozására. Az oszlopból a hemoglobint kis ionerősségű pufferrel, azaz 0,005 mólos foszfáttal távolítjuk el, a vörös vérsejtek oldható fehérjéinek az oszlopra felvitt minden egyes mennyisége után. Ez az eljárás addig folytatható, míg orgotein-nyomok meg nem jelennek az elutáumban (mint az a peroxid-diszmutáz aktivitás megjelenése és/vagy a réz- és cinktartalom megnövekedése útján észlehető). Az orgotein ezt követően szelektíven eluálható a hemoglobintól mentes, orgoteinnel töltött .oszlopból közepes erősségű, azaz mintegy 0,02—0,04 mól ionerősségű pufferrel. Ha az orgoteint eluáljuk az oszlopból, az orgotein megszabadítható a szénsavanhidráztól és más szennyeződésektől a későbbiekben ismertetett hőkezelés útján. A kicsapott fehérjék eltávolítása és 0,01 mól ionerősség alatti értékre történő dializálás után az orgotein adott esetben tovább tisztítható egy kisebb, azaz 0,05—0,5 ml/ml orgotein arányú, DEAE-cellulózzal töltött második ioncserélő oszlopon, melyet a 4. példában ismertetett módon kezelünk. A találmány szerinti eljárás egy további változata szerint az elroncsolt és dializáit vörös vérsejteket szuszpendáljuk mintegy 0,25-1 térfogat/térfogat gyanta arányban DEAE-cellulóz bázisú ioncserélő gyantával, majd a kapott szuszpenziót szűrjük vagy centrifugáljuk, és addig mossuk, míg hemoglobintól mentes nem lesz. A hemoglobintól mentes gyantát ezután szuszpendáljuk vagy minimális mennyiségű közepes ionerősségű pufferrel mossuk, azaz olyan 0,005 mólos foszfát-pufferrel, melynek ionerősségét nátrium-klorid adagolása útján 0,04 mólra növeltük, hogy a pufferben újra oldjuk az orgoteint. A gyanta megtisztítható az adszorbeálva maradt fehérjéktől nagyobb ionerősségű, azaz 0,1 mólos pufferrel végzett kezelés útján, majd ismert módon regenerálható és kiegyensúlyozható. Az orgoteint és más feloldódott fehérjéket ezt követően adszorbeáljuk és szelektíven eluáljuk a fentiekben ismertetett módon kis mennyiségű DEAE-cellulózzal (azaz 0,1—0,25 ml gyanta/ml oldat arányban) töltött oszlopon, és/vagy hőkezelési lépésnek vetjük alá. A találmány szerinti eljárás egy további előnyös foganatosítási módja értelmében a mintegy 0,01 mól alatti ionerősségű eluálószerrel eluálható fehérjéktől megtisztított oszlopot megtisztítjuk a legtöbb vagy az összes, orgoteintől idegen fehérjétől oly módon, hogy az oszlopot mintegy 5—20 percen át 65—70 C°-on tartjuk felmelegített 0,005 mólos foszfát-puffer keresztüláramolíatása útján. Az orgotein az eluátumból ismert módon, így például liofilizálás útján különíthető el, előnyösen a 5 puffer-ionok eltávolítására ionmentes vízzel szemben végzett dialízis után. A találmány szerinti eljárás elkülönített orgotein jó minőségű és injektálható immunológiai mellékreakciók nélkül. Mint azt a 3 579 495 számú amerikai 10 egyesült államokbeli, a 687 828 számú belga és az 1 160 151 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásokból ismerjük, az orgotein többek között gyulladásgátlóként hasznosítható. A fenti módon előállított orgotein azonban nyomnyi mennyiségekben más fe-15 hérjéket is tartalmazhat, melyek bár azonnali immunológiai reakciót nem váltanak ki, azonban potenciális képességgel rendelkeznek, hogy hosszabb időn át tartó parenterális adagolás esetén ilyen nem kívánatos immunológiai reakciókat kiváltsanak. Ezek a nyom-20 nyi mennyiségű fehérjék számos módon eltávolíthatók. Például a gélszűrés útján, amikor is szűrőként mikropórusos gyantát, azaz SephadexG-75 márkanevű terméket (epiklórhidrinnel térhálósított dextrán, gyártó cég: Pharmacia, Svédország) használunk. A 25 Sephadex gyantát duzzasztjuk, finomítjuk és mossuk a gyártó cég által előírt módon. A töltött oszlopot kiegyensúlyozzuk pH 7,5 értékű 0,05 mól TRISZ-hidrokloridot 0,15 mól kálium-kloridot, 0,005 mól glicint, 10~4 mól Cu* - és 10~ s mól Zri^-iont 30 tartalmazó pufferrel, majd az átfolyási sebességet óránként mintegy 2,0 ml/cm2 értékre állítjuk be. 5-10% dextróx vagy szacharóz adagolása az oldathoz megnöveli a feltöltés egységességét, miáltal nő az oszlop azt követő felbontóképessége. A feltöltés után 35 pufferoldat adagolása útján eluálunk. Az egyes különálló frakciókat összegyűjtjük. A csúcsok megjelenését az abszorpció valamely 200 nm és 280 nm közé eső hullámhosszon végzett mérése útján észleljük. 40 Igen tiszta orgotein előállítható DEAE-cellulózzal elkülönített orgoteinből is, ha orgoteint, valamint Cú1 *'- és Zrí*-ionokat, tartalmazó frakciót utólagos hőkezelésnek vetünk alá, azaz 15 percen át pH 5,8-en 65—75 C°-on tartjuk, majd a frakciót centrifugáljuk 45 és dializáljuk, végül újból DEAE-cellulózzal kromatográfiás kezelésnek vetjük alá, vagy proteolitikus enzimmel kezeljük a frakciót, mint azt már korábban ismertettük. A találmányt közelebbről az alábbi példákkal 50 világítjuk meg. 1. példa Orgotein elkülönítése szarvasmarhamájból 212 gramm szarvasmarhamájat 2cm-es szeletekre 55 vágunk, majd eltávolítjuk a kapcsolódó szöveteket és vérereket, a vért kimossuk és az így kezelt szeleteket 19000 fordulat/perc sebességű keverővel (Osterizer típusú) 3,8 ml puffer/g máj arányban 0,025 mól TRISZ-hidrokloridot 0,3 mól szacharózt és 0,05 mól 60 kálium-kloridot tartalmazó pufferrel összekverjük. A homogenizált elegyet ezután centrifugáljuk (20 000 g, 0, °C, 60 perc); a fázisokat elválasztjuk, a felülúszó fázist 0,005 mólos pH 6 értékű foszfátoldattal szemben dializáljuk, majd újra centrifugálunk és a 65 kapott felülúszó fázist Versapore típusú mikropóru-6
