168354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és próbapapir testfolyadék egy komponensének kromogén vegyületek oxidációján alapuló meghatározásra
168354 7. példa A 6. példa f) bekezdésében említett vizeletminta 1 ml-éhez 50 mg 5. példa szerint előkezelt cellulózport adunk. Az így kapott keveréket 1 percig rázzuk, azután a folyadék 0,1-ml-ét a 6. példa szerinti módon vizsgáljuk HCG-re oxidálatlan próbapapírral. Jelentős kék színeződést tapasztalunk. 8. példa A 6. példa szerinti próbát elvégezhetjük olyan próbapapírral is, amely az összes szükséges reagenst tartalmazza. Ezt a viszgálatot az alábbiak szerint hajtjuk végre. 28,6 ml desztillált vízhez 11,43 g CuS04 • 5H 2 0-t adunk, miközben a vizet 95 C°-ra melegítjük. A kapott oldatot 50-60 C°-ra hűtjük le. Hozzáadunk 22,86 ml 25%-os ammóniát, ekkor Cu (OH)2 csapadék válik ki, amely azonban újra oldódik további ammóniaadagolás közben. Ekkor az oldatot 0-5 C -ra hűtjük le, azután 800 mg szacharózt és 100Ö mg m-amino-benziloximetilcellulózt" adunk hozzá. Ez utóbbi cellulóz előállítását az alábbi irodalmi helyen találjuk: Methods in Immunology and Irnmunochemistry, 1. kötet, C. A. Villiams and M. W. Chase (Academic Press, New York, London 1967, 378. old.). Ezután a keverékhez 5,7 ml 10 n nátrium-hidroxidot adunk, amikor is a cellulózszármazék teljesen feloldódik. Whatman 3 MM szűrőpapír 20X8 cm-es csíkját a 4. példa szerinti módon kezeljük, azután 0,5 mólos KH2P0 4 oldattal itatjuk át, megszárítjuk, és felviszünk rá egy 15 ml széles csíkot az előbbi réz-cellulóz oldatból. A primer foszfát jelenléte miatt a pH annyira lecsökken, hogy az oldott cellulóz kicsapódik a papíron. Kék sáv válik láthatóvá. A papírt hideg 0,1 n kénsawal mossuk egy ideig, miközben a mosófolyadékot rendszeresen felfrissítjük. Ez a művelet, melynek célja az összes réznyom eltávolítása, 24 órát is igénybe vehet. Ezután 14 g nátrium-nitritet feloldunk 1000 ml 1,6 n kénsavban. A papírt ezzel az oldattal kezeljük 30 percig, miközben az oldatot 3—4-szer felfrissítjük. Ezután a papírt desztillált vízzel semlegesre mossuk, azután 3,1 g bórsav és 20 ml nátrium-hidroxid desztillált vízben való oldásával, a pH-riak 4 n nátrium-hidroxiddal 8,6-re való beállításával és az oldat desztillált vízzel 1 literre való feltöltésével készült borátpufferbe áztatjuk. Ezt a borátpuffert juh anti-(nyúl-gamma-globulin) 8,6 pH-jú borátpufferrel készített 2,5 mg/ml koncentrációjú oldatával váltjuk fel, és a papírt egy éjszakán át áztatjuk ebben az oldatban, miközben a papír és a puffer pH-ját 8,6 értéken tartjuk. Ezután a globulinoldatot dekantáljuk, és a papírt ß-naftol 8,6 pH-jú borátpufferrel készített telített oldatával kezeljük. Ez utóbbi kezelést szobahőmérsékleten végezzük. A papírt 6ß pH-jú 0,1 mól-os foszfátpufferrel mossuk a 6. példa szerinti módon, azután megszárítjuk. Ezután a papírra felvisszük a reakciókomponenseket, vagyis egy csíkot húzunk a papíron redukált ÖCPIP oldattal, egy karbamid-hidrogén-peroxid csíkot (1,6%-os etanolos oldat), ez alatt egy cellulóz juh anti-(nyúl-gamma-globulin) csíkot, ez alatt egy HCG-peroxidáz konjugát csíkot, végül az utóbbi alatt egy antiszérum (nyúl anti—HCG) csíkot. Az utóbbi két komponenst ekvivalens mennyiségben alkalmaz• zuk oly módon, hogy a 2 U HCG/ml tartalmú vizelet pontosan megkösse az antiszérum mennyiségét. E célból minden papír felszívó kapacitását újra meg újra 5 meg kell határozni. Ha a papírra az összes komponenst felvittük, a papírt megszárítjuk és 7 mm szélességű csíkokra vágjuk. Ha vizeletet szívatunk fel a papírra és ahban elegendő mennyiségű HCG van, mely jelzi a terhessé-10 get, akkor az abszorbeált vizelet megköti az antiszérumot, a papírban magával viszi a HCG-peroxidot, útközben elegendő hidrogén-peroxidot szabadít fel a karbamid-hidrogén-peroxidból, végül a peroxidáz és a hidrogén-peroxid reagál a redukált DCPJP-vel, amikor 15 kék szín jelenik meg. Ha nincs terhesség, akkor az antiszérum reagál a HCG-peroxidáz konjugáltai és az így képződő komplexet megköti a juh anti-(nyúl-gamma-globulin) zóna. így a peroxidáz nem éri el a redox indikátort és a papír 20 színtelen marad. 9. példa Glükóznak a testfolyadékokban való kimutatására egy szűrőpapírt a 3. példa szerint kezelünk. A papírt 25 ezután az alábbi reangenseket tartalmazó oldattal telítjük: 200 mg glükóz-oxidáz 5 mg torma-peroxidáz 100 mg o-toluidin 30 600 mg citromsav 1275 mg nátriumcitrát-dihidrát 20 ml víz Szárítás után az így készített papírcsíkokat eredményesen használhatjuk glükóznak testfolyadékok-35 ban való meghatározására a szokásosan jelenlevő zavaró redukáló anyagok mellett. Ugyanilyen jó eredményt érhetünk el, ha o-toluidin helyett a 2,6-diklór-fenol-indolfenol redukált formáját használjuk, (lásd a 10. példát) 40 10. példa A 9. példában leírt papírt az alábbiak szerint készítjük elő glükóz kimutatására. a) 5 ml vízben feloldunk 100 mg C-vitamint, az 45 oldathoz hozzáadjuk 100 mg DCPIP és 400 mg PVP 35 ml abszolút etanollal készített oldatát. b)Egy 4. példa szerinti módon előkezelt szűrőpapírt 5,6 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferrel itatunk át, azután megszárítjuk. Ezután az a) bekezdés szerint 50 készített redukált DCPIP oldatból 5 mm széles csíkot viszünk fel a megszárított papírra. c) Az előbbi csík alá egy további csíkot viszünk fel 200 mg glükóz-oxidáz és 5 mg torma: peroxidáz 20 ml vízzel készített oldatából. 55 d) Az így kapott papírt megszárítjuk, és a vizsgálandó folyadékot oly módon szívatjuk fel a papírból vágott csíkokra, hogy a folyadék a redox_indikátor elérése előtt áthaladjon az enzimrendszeren. Az így kapott kék színű erőssége többszörösen nagyobb a 60 kezeletlen papírral végzett kísérletben kapott kék színnél. 11. példa Igen kis mennyiségű galaktóznak a tesfolyadékok-65 ban való kimutatására, mely vizsgálatot az általában 3
