168313. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biotin mikrobiológiai úton történő előállítására
3 168313 4 organizmus tenyésztésére használható tápanyagok azok lehetnek, amelyeket mikroorganizmusok tenyésztésére szokásosan alkalmaznak. így például szénforrásként n-paraffin, ecetsav, kerozin vagy ezek kombinációja előnyös, bár glukóz, keményítő, glicerin vagy szorbóz is használható, nitrogénfonásként pedig pepton, kukoricalekvár, szójababpor, ammónium-klorid, ammónium-nitrát, ammónium-szulfát, karbamid vagy ezek keverékei használhatók. Továbbá szervetlen sóként nátrium-klorid vagy egy foszfát használható, nyomelemként pedig a magnézium, vas, mangán, kobalt, cink vagy réz szulfátja vagy hidrokloridja. A tápközeg pH-ja 6 és 8 között lehet, előnyösen 7, ha baktériumot használunk; penészgomba vagy élesztő alkalmazása esetén pedig 4 és 7, előnyösen 5 és 6 között lehet. A tenyésztés hőmérséklete 25—37 °C előnyösen 25—30 °C baktériumok esetében, és 22—30 °C, előnyösen 25 °C körüli élesztő vagy penészgomba esetében. A tenyésztés során a levegőztetés és keverés kedvező eredményeket ad. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárásban a biotin képződését megelőzően közbenső termékként biotinol keletkezik. Ha a biotinol összegyűjtése kívánatos, a tenyésztés vagy inkubálás a biotinol keletkezésekor leállítható. A találmány szerinti eljárás végrehajtásakor bármelyik fent említett mikroorganizmust a fent említett tápanyagokat tartalmazó tápközegben tenyésztjük. A megfelelő szerves oldószerben, pl. etanolban, metanolban vagy dimetil-formamidban oldott (II) képletű vegyületet a mikroorganizmus szaporodásának kezdetétől vagy azt követően adagoljuk, és a tenyésztést 2—7 napig folytatjuk. A (II) képletű vegyület koncentrációja a közegben 0,05—0,3%, előnyösen 0,1-0,2% lehet. A tenyésztés után a tápközegben előállított biotin elválasztható és tisztítható. Erre a célra a tápközegből egy adott termék extrahálására általánosan használt valamely eljárás alkalmazható. így például a sejteket eltávolítjuk a tápfolyadékból, a szűrletben levő anyagot aktív szénen adszorbeáljuk, majd eluáljuk, és ioncserélő gyantával tisztítjuk. Más lehetőség szerint a szűrletet közvetlenül ioncserélő gyantával kezeljük, és eluálás után a kívánt terméket vízből vagy alkoholból átkristályosítjuk. Bizonyos esetekben a szűrlet ioncserélő gyanta használata nélkül is koncentrálható, és a kiváló kristályokat a folyadék pH-jának izoelektromos pontra történő állítására gyűjtjük össze. Mikroorganizmusokra néhány példát az alábbiakban sorolunk fel: 1. Pseudomonas mutabilis (B-3252 FERM-P No. 1429.). 2. Corynebacterium primorioxydans (B-321 FERM-P No, 1427.). 3„ Corynebacterium primorioxydans var. forte (B. 323 FERM-P No. 1428.). 4. Arthrobacter paraffineus (ATCC 21003.). 5. Brevibacterium ketoglutamicum (ATCC 21004.). 6. Mycobacterium smegmatis (IFO 3083.). 7. Nocardia corallina (IFO 3338.). 8! Candida arborea (IAM 4147.). 9. Cuninghamela blakesleeana (IFO 4443.). 10. Cladosporium herbarium (IFO 4458.). 11. Gibberella fujikuroi (ATCC 14842.). 12. Penicillium chrysogenum (ATCC 7326.). 13. Penicillium patulum (ATCC 10120.). 14. Mucor microsporus (ATCC 8541.). Az első három fenti törzset újonnan izoláltuk és 5 azonosítottuk, mikrobiológiai jellemzőiket és azonosításukat a következőkben adjuk meg. Az azonosítás Bergey: Manual of Determinative Bacteriology 7. kiadásán alapul. Az 1. törzs sejtvégi ostorral rendelkezik és lánco-10 kat képez, pálcika alakú, emiatt ez a törzs Pseudomonadales. Továbbá fotoszintetikus pigmentje nincs, zöldes színű, vízben oldódó pigmenteket képez, ezért Pseudomonadineaekhez tartozik. Továbbá rövid pálcika, nem kapcsolódik szubsztrátumhoz, oxidatív, 15 némely esetben fermentatív, a glukózt oxidatív vagy fermentatív úton megtámadja, nem termel H2 -t és C02 -t, ezért a Pseudomonas nemzetséghez tartozik. Ezeket az említett könyvben szereplő Pseudomonas jellemzőkkel összehasonlítva a törzs leginkább a 20 Pseudomonas striata-hoz hasonló. De a B—3252 ettől abban különbözik, hogy ovális alakú vékony pálcákat is képez, és ferde agáron nem válik sárgászöld színűvé. Egyébként a Bergey-féle könyv elég szűkszavú, így nehéz összehasonlítást tenni, és állíthatjuk, hogy a 25 B—3252 különbözik a Pseudomonas striata-tól. Az Iizuka et al. [J. Gen. Appl. Microbial 10, 207 (1964) és J. Gen. Appl. Microbial 9, 73 (1963)] által leírt törzsekkel, a Pseudomonas nitroreducens-szel, Pseudomonas maltophylaval és Pseudomonas desmo-30 lytica-val összehasonlítva a B—3252 a Pseudomonas nitroreducens-től abban különbözik, hogy gáz alakú nitrogént nem termel, kénhidrogént termel, továbbá a cukorból történő savtermelésben tér el. A Pseudomonas maltophyla-tól is különbözik a lakmusz-35 tejen vagy szukcinát-nitrátoldatban való szaporodásban, a Pseudomonas desmolytica-tól pedig a nitráttermelésben. A fent említettek miatt a B-3252 törzs nem tartozik egyik ismert Pseudomonas nemzetséghez sem, 40 ezért Pseudomonas mutabilis B—3252-nek neveztük el. A 2. és 3. törzs az Eubacteriales II-höz tartozik, nincs endospórájuk, több alakúságot mutatnak, a sejtek sarjadnak, hirtelen osztédnak és bunkó ala-45 kúak. Ezek a törzsek ezért a Corynebacteriaceghez tartoznak. Továbbá nincs peritrich ostoruk, katalázpozitívek, Gram-pozitívek, ezért Corynebacteriumokhoz tartoznak. Ezeknek a törzseknek a különböző tulajdonságait a Bergey-féle könyvben említett törzse-50 kével összehasonlítva azt találtuk, hogy a B-321 törzs leghasonlóbb a Corynebacterium agrapyri-hez és Corynebacterium facians-hoz, de az előzőtől folyékony tápközegben való szaporodásában és cukorból való savtermelésében különbözik, míg az utóbbitól a 55 lakmusztejen való szaporodásban és cukorból való savtermelésben. így a B-321 törzset a Bergey-féle kézikönyv nem tartalmazza. A Yamada et al. [Agr. Biol. Chem. 27, 773 (1963)] által leírt Corynebacterium törzzsel összehasonlítva attól a keményítőbontó 60 képességben különbözik, és nem mondható avval azonosnak. Az Iguchi et al. [Amino Acid & Nucleic Acid 11, 86 (Í963)] által leírt Corynebacterium petrophylum-tól a szaporodási hőmérsékletben, nitrittermelésben, kénhidrogén-termelésben és cukorból 65 való savtermelésben különbözik, a Takahashi et al. 2
