168190. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóznak glukozból rögzített enzimmel való előállítására

3 168190 4 kozott a glükóz-izomeráz vizsgálatával abban a reményben, hogy sikerül gazdasági szempontból is előnyös enzimes módszert találni fruktóz előállítására. Legkorábban a 2 950 228 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban foglalkoztak a glükóz enzimes izomerizációjával. Néhány esetben azonban azt találták, hogy még a rendkívül specifikus enzimes izomerizációnál is tartalmazhat a fruktóz végtermék nem kívánt festékanyagokat. A 3 623 953 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismertet egy módszert, amellyel elkerülik vagy a minimálisra csökkentik az ilyen festék képződését. A módszer szerint az izomerizációs oldathoz különféle szulfitsókat adnak, ezáltal a festékképződés a minimumra csökken, és a glükóz-izomeráz stabilitása egyidejűleg fokozódik. A 3 694 314 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás eljárást ismertet glükóznak fruktózzá történő enzimes átalakítására, melynek során glükóz-tartalmú oldatot vezetnek át intracelluláris glükóz-izomerázt tartalmazó mikroorganizmussejtekkel töltött ágyon, olyan körülmények között, mely megakadályozza az izomeráznak a sejtekből való extrakcióját. A 2 086 752 sz. francia szabadalmi leírás ugyancsak glükóznak fruktózzá történő enzimes izomerizációját ismerteti, olyan glükózoldatból, mely kis mennyiségű vízoldható szulfátot tartalmaz, a színvizsgálat elősegítésére. A 2 061 371 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat rögzített glükózizomeráz enzimkomplex előállítását ismerteti, melynek során glükózizomerázt bázikus anioncserélő cellulózzal kezelnek, vizes pufferoldatban, 7 és 10 közötti pH-értéken. Általában korlátozott volt az enzim alkalmazhatósága ipari eljárásoknál, mivel az enzim igen költséges és vízben oldódik, így használat után nehéz eltávolítani. Ily módon az enzimek csak egyszer használhatók és gyakran a termékben maradnak, mivel az eltávolítás igen költséges volna. Az utóbbi években olyan eljárásokat dolgoztak ki, melyek révén az enzimeket „rögzítették" vagy „oldhatatlanná" tették, mégpedig vagy lényegében oldhatatlan hordozóanyagokra adszorbeálták azokat, vagy kémiailag kötötték a hordozókhoz és az így kapott enzim-készítményt könnyen el tudták távolítani. Az enzimek megkötésére alkalmasak szerves anyagok, például különféle cellulózszármazékok, poliamino-sztirol stb. és különböző szervetlen anyagok, például porüveg és szilikon xerogélek. Gyakran előnyösebb a szervetlen anyagok hordozóként történő alkalmazása, mert nagyobb az ellenállóképességük, nem duzzadnak és nagy a hőstabilitásuk. Különböző enzimek adszorbeálódását kovasavtartalmú anyagokra a 3 556 945 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban írták le, enzimek megkötését szervetlen hordozókon pedig a 3 519 538 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban említik. Bár az enzimek szervetlen anyagokra történő adszorbeálásának sok előnye van, mégis néhány hátrányos szempont megakadályozta az ipari alkalmazást. Például igen költséges a kovasavtartalmú hordozók, például a porüveg előállítása. Továbbá a porüveg és a kovasav-tartalmú xerogélek nem rendelkeznek elég lúgállóképességgel, ez a tulajdonság viszont igen fontos hosszabb használat esetén olyan enzimrendszernél, mint a 5 glükóz-izomeráz, melynek lúgos pH-optimuma van. Ezért a kutatók olyan hordozóanyagokat kerestek, amely rendelkezik a szervetlen hordozók kedvező tulajdonságaival, azonban a fent említett hátrányokkal nem. Meglepő módon sikerült találnuk egy 10 olyan hordozót, amely a glükóz-izomeráz rögzítésére kiválóan alkalmas. A találmány tárgya javított eljárás fruktóz előállítására glükóz-tartalmú oldatból rögzített enzimkészítmény felhasználásával, és az jellemzi, hogy 15 a glükóz-izomerázt olyan porózus alumíniumoxid felületére adszorbeáljuk, melynek pórusai átlagosan 100 —1000 A átmérőjűek. A porózus alumíniumoxid hordozó előnyösen 25-80 mesh részecskeméretű (Amerikai Egyesült Államok-beli standard 20 szitasor). Az enzimet a porózus alumíniumoxid részecskékhez kötve átfolyásos reaktorba helyezzük, és a glükóz-tartalmú oldatot folyamatosan adagoljuk a reaktorba, izomerizációs körülmények mellett. Az inkubációs hőmérséklet előnyösen 50—70 C°. Elő-25 nyösen alkalmazhatunk puffer-rendszereket a reakció folyamán, előnyösen 7,2—9,2-n, különösen előnyösen 7,4-7,8 értéken tartva a pH-értéket. Mivel a hordozó porózus alumíniumoxid, a kapott enzim-készítménynek jó az alkálitűrése abban a 30 pH-intervallumban, melyben a megkötött glükóz-izomeráz optimális aktivitást mutat. A találmány egyik igen fontos tényezője a porózus alumíniumoxid a glükóz-izomeráz megkötésére. A hordozó átlagos pórusátmérőjének 35 100  és 1000  között kell mozognia, hogy az enzim maximálisan telítse a hordozót. A 100  alsó határt a glükóz-izomeráz molekula legnagyobb dimenziója szabja meg, amely megközelítőleg 100 Â. Az átlagos pórusméretnek legalább lOOÂ-nak kell 40 lenni, hogy a molekula behatolhasson a pórusokba és megtörténjék az enzim tömeges diffúziója mélyen a pórusok belsejében, mielőtt kezdetét veszi a hordozó belső felületén a végső adszorpció. A glükóz-izomeráz hosszú molekula. Ily módon, ha 45 olyan porózus alumíniumoxidot használunk, melynek legnagyobb dimenziója 100  és az átlagos pórusátmérő is legalább ekkora, akkor biztosítva van a molekulák behatolása a pórusokba. így az enzimet nagy belső felületre vihetjük fel. 50 Az is fontos, hogy az alumíniumoxid hordozó átlagos pórusméretei ne legyenek nagyobbak 1000 A-nél. Ennek több oka van. Ha a szervetlen hordozó átlagos pórusmérete nagyobb, mint 1000 Â, akkor lényegesen csökken a belső felület, ahol az 55 adszorpció, tehát az enzim megkötése történik. Továbbá, ha az átlagos pórusméret nagyobb, mint 1000 Â, akkor a merev belső struktúra a pórusokban a környezeti hatásokkal szemben kisebb védelmet nyújt az enzimnek, az eltávolítás ellen. 60 Például, ha a rögzített enzimet folyamatos oszlopban használnánk, az oszlopban a nyomásesés olyan turbulens környezetet hoz létre, amely az 1000Â-nél nagyobb átlagos pórusméretű pórusokban adszorbeált enzim leválasztását eredményezi. 65 így, minthogy az enzim megkötéséhez viszonylag 2