168032. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjekészítmények előállítására

168032 gítjük, majd szűrjük. A maradékot 20 ml jéghideg vízben felvesszük, keverés közben előbb 300 g nátriumnitritet, majd 20 térfogat %-os lúg sósavat adunk hozzá pH = 1-2 érték eléréséig. A reakcióelegyet 10 percen át 0 C°-on keverjük, majd a pH-t nátrium-hidr- 5 oxid-oldattal 5-re állítjuk be és a felső folyadékot dekantáljuk. A maradékot sósavval pH = 4-5 értékre beállított vízzel többször mossuk, míg a felül elhelyezkedő folyadék dekantáláskor színtelenné válik. Az ily módon kapott részecskéket közvetlenül fel- 10 használjuk az enzim-megkötéshez. A terméket 6,5 pH-jú foszfátpufferben 24 órán át 4 C°-on tárolva a megkötési kapacitás észrevehető mértékben nem csökken. A fenti eljárással analóg módon porózus üveg 15 (részecskenagyság: 40-200 mesh USA szabvány, szemcsenagyság 10—200 mm) alumínium-oxid, cellulóz és poliamid felhasználásával további hordozóanyagokat állítunk elő. Az alumínium-oxidot, cellulózt, poliamidot és üveget az előző bekezdésben leírt módon kezeljük. 2. példa 1 g, az 1. példa szerint előállított hordozóanyagot 25 ml jéghideg enzim-oldathoz (lásd táblázat) adunk 0,05 mólos 6,5-7,8 pH-jú foszfát-pufferben (fehérjetartalom 1-8 mg) és 4C°-on 0,5-20 órán át enyhén rázogatjuk. Az elegyet szűrjük, a részecskéket 50 ml 1 mólos kálium-klorid-oldattal mossuk, 20 ml 0,05 mólos 6,5 pH-jú citrát pufferben vagy foszfát-pufferben szuszpendáljuk és 4 C°-on tároljuk. Az ily módon kapott enzim-készítmények aktivitását az alábbi táblázatban tüntetjük fel. Táblázat Hordozó alap: porózus üveg Enzim Bemért enzimmennyiség [mg fehérje] [egység] Aktivitás pro g hordozó [egységek] i Szubsztratum Naringináz 1 3,4 1,9 Naringin 2,3 8 2,4 Amiloglükozidáz 4 192 50 Keményítő 8 384 90 Hesperidináz 2 10,4 4,6 Hesperidin-dihidro-kalkon Ficin 2 1,2 0,38 Kazein Tripszin 2,5 5,5 1,9 N-Benzoil-dl-arginin-4-nitroanilid Bromalin 2 1,1 0,32 Kazein , (3-Glükozidáz 2 8,8 2,3 N-Nitro-fenilglükopiranozid Hordozó alap : szilikagél Naringináz 3 10 1,8 Amiloglükozidáz 2 90 9,4 Tripszin 2,5 5,5 2,1 lásd fent Ficin 2 1,2 0,44 Bromalin 2 1,1 0,35 j3-Glükozidáz 2 8,8 1,76 3. példa 1 g cellulózt (gyapotszálak) 200 mg 4,4'-diaminodifenilmetánnak 10 ml vízmentes benzollal képezett oldatához adunk. Az elegyet 3 percen át időnkénti 50 rázogatás közben 80 C°-os vízfürdőn melegítjük, majd a benzol teljes eltávolításáig vákuumban leszívatjuk. Az ily módon diaminnal kezelt gyapotszálakat 20 ml jéghideg vízhez adjuk és rázogatás közben előbb 300 mg nátriumnitritet adunk hozzá, majd a pH-t híg (20 55 térfogat %-os) sósavval 1-2-re állítjuk be. A reakcióelegyet további 10 percen át keverjük, majd a felső részt dekantáljuk. A maradékot jéghideg vízzel többször mossuk. Az ily módon előkészített gyapotszálakat közvetlenül felhasználjuk enzimek megköté- 60 sere. 4. példa 1 g, a 3. példa szerint aktivált cellulózt 2 mg heszperidinázhoz [10,4 aktivitási egység, heszperidin- 65 dihidrokalkon szubsztrátumon Borel, Hostetter és Denel szerint Helv. Chim. Acta 35, 115 (1952) meghatározva] adunk 25 ml jéghideg 0,05 mólos pH = 6,5 foszfátpufferben. Az elegyet 1 órán át 4 C°-on rázatjuk majd szűrjük és a maradékot 1 mólos kálium-klorid-oldattal és a pufferrel mossuk. A cellulózhoz kötött heszperidináz aktivitása 1,9 egység/g cellulóz. 5. példa 1 g kromatografálási célokra alkalmas alumíniumoxidot (Woelm-Eschwege) 200 mg 4,4'-diamino-difenilmetán és 10 ml vízmentes benzol oldatához adunk. Az elegyet 5 percen át időnkénti rázogatás közben vízfürdőn (80 °C) melegítjük, majd a benzol teljes mennyiségének eltávolításáig vákuumban leszívatjuk. Az aromás diaminnal ily módon kezelt alumíniumoxid-részecskéket 20 ml jéghideg vízhez adjuk, majd keverés közben előbb 300 mg nátriumnitritet adunk 2