168000. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-nitroacetil-benzoesav-származékok előállítására
168000 8 oldatához 0,003 mól 5,6-dimetil-3-nitrometilén-ftalidot adunk, és az elegyet szobahőmérsékleten rázzuk. Elszíntelenedés után az elegyhez 50 ml vizet adunk, és így a 2-nitroacetil-4,5-dimetil-benzoesav-metilésztert kicsapjuk. A termék etanolos átkristályosítás 5 után 139-139,5 C°-on olvad. Hozam: 98%. Biológiai vizsgálatok és azok eredményei A fenti módon előállított (I) általános képletű vegyületek egy részét biológiai vizsgálatnak vetettük alá. A vegyületek hatását patkányon, passzív kután 10 anafilaxis módszerrel vizsgáltuk. A vizsgálati módszert a ii) pontban részletesen ismertetjük. i) Patkányokon Mota módszerével [Immonology 7, 681. (1964)] hőre érzékeny homocitotróp antitesteket tartalmazó vérszérumot feilesztünk ki. 15 250-300 g testsúlyú hím Wistar-patkányoknak intraperitoneális injekció formájában 0,5 ml Bordetella pertussis vakernát (koncentráció: 4X1010 elhalt mikroorganizmus/ml) és szubkután injekció formájában 0,5 ml ovalbumin-ernulziót (összetétel: 100 mg 20 ovalbumin, 2 ml fiziológiás sóoldat és 3 ml nem-teljes Freund-adjuváns) adunk be. 18 nappal a kezelés után a patkányokat szívpunktúrával kivéreztetjük, a kapott vérmintákat egyesítjük, a vérszérumot elkülönítjük, és -20 C°-on tároljuk. A vérszérumot csak közvetlenül felhasználás előtt hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. ii) A passzív kután anafilaxis-tesztet (PCA-teszt) Ovary és Bier [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 81, 584. (1952)], illetve Goose és Blair [Immunology 16,769. (1969)] módszerével végezzük. Az i) lépésben kapott vérszérumból 0,9%-os sóoldattal sorozathígítást készítünk; a sorozat egyes tagjait minden esetben kétszeres térfogatra hígítjuk. 6 különböző hígítású szérummintát intradermális injekció formájában 250-300 g súlyú Wistar patkányok borotvált hátbőrébe fecskendezünk. Az egyes mintákat különböző helyekre fecskendezzük, minden injekcióhoz 0,1 ml térfogatú elegyet használunk fel. 72 óra elteltével az állatoknak intravénás injekció formájában 0,3 ml 1%-os ovalbumin-oldat és 0,1 ml 5%-os „pontamine" égszínkék festékoldat (oldószer: Sorenson-pufferoldattal (PBS) 7,2 pH-értékre pufferolt izotóniás sóoldat) elegyét adjuk be. 20 perc elteltével az állatokat leöljük, és megmérjük az antitest-injekciók beadásának helyén kialakult kék foltok átmérőjét. A szérum koncentrációját úgy állítjuk be, hogy a maximális hígítású minta beadásának helyén az antigén-injekció ne váltson ki reakciót, míg a maximális mértékű reakció a két-három legkisebb hígítású minta beadásának helyén lépjen fel. A kísérlet során az 1/4-1/128 hígítású mintákat használjuk fel. . Az értékelés során azt vizsgáljuk, hogy a hatóanyagok milyen mértékben csökkentik a kék foltok átmérőjét a kontrollokhoz viszonyítva. Azonos szérumhígításokhoz tartozó foltokat hasonlítunk össze, és csak azokat a foltokat vizsgáljuk, amelyek esetén a kontrolloknál még nem lép fel maximális reakció. A hatóanyagot Sorenson-pufferoldatban oldva vagy 60 1%-os metilcellulózban szuszpendálva, szubkután injekció formájában adjuk be a patkányok nyakszirtjébe. A kezelést meghatározott idővel az ovalbumin-injekció beadása előtt végezzük. A kontroli-állatoknak ugyanekkor azonos hordozóanyagot tartalmazó, 65 azonban hatóanyag mentes szubkután injekciót adunk be. A kísérleteket 6-6 állatból álló csoportokon végezzük. A passzív kután anafilaxis (PCA) gátlását az alábbi egyenlettel számítjuk ki: %-os gátlás = 100 (1-a/b) ahol a = a kezelt állatokon kialakult kék foltok átlagos átmérője, és b = a kontroli-állatokon kialakult kék foltok átlagos átmérője (mindkét esetben csak azokat a foltokat vesszük figyelembe, ahol a kontroli-állatokon még nem jelentkezik maximális reakció). A hatóanyagot előnyösen pH = 7,2 értékű pufferoldattal készített, nátrium-hidrogén-karbonáttal semlegesített oldata formájában adjuk be. Oldhatatlan nátriumsót képező vegyületek esetén első lépésben s szabad savból 2,5 n nátrium-hidroxid-oldattal sót képezünk, a sót leszűrjük, vízzel lúgmentesre mossuk, szárítjuk, majd 1%-os metilcellulózban szuszpendálva adjuk be. A vizsgálatok eredményeit az 1. táblázatban közöljük. 1 . táblázat ">5 Hatóanyag Dózis Idő PCA-reakció %-os gátképlete mg/kg perc lása (VII) 25 0 22 30 (1. példa) 100 0 34 25 60 51 100 60 58 (VIII) 25 0 12 (2. példa) 100 0 16 35 25 60 53 100 60 42 (IX) 25 0 7 (3. példa) 100 0 11 25 60 44 40 100 60 54 (X) 25 0 30 (4. példa) 100 0 30 25 60 20 100 60 41 45 (XI) 25 0 8 (5. példa) 100 0 14 25 60 -13 100 60 -2 (XII) 25 0 33 50 (6. példa) 100 0 57 25 60 13 100 60 32 (XIII) 25 0 2 (7. példa) 84 0 > 23 55 25 30 11 84 30 21 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására — ahol R jelentése hidrogénatom, vagy rövidszénláncú alkucsoport, Ri,R2 , R 3 és R 4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, rövidszénláncú alkilcsoport vagy
