167919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-25822 jelű antibiotikum- komplex komponensei előállítására
17 167919 18 5. táblázat Az A 25822 antibiotikumok kromatográfiás elkülönítésére bázikus alumínium-oxiddal AntibiotikumAntibiotikumkombinációk Frakciók komponensek I 7-8 MésN II 9-23 A és L III 24-42 BésH IV 43-48 B V 55-70 D Az egy-egy azonos csoportba tartozó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor olajos desztillációs maradékot kapunk. 500 mg, M és N (1. 5. táblázat I) vegyületet tartalmazó terméket 20 ml acetonban oldunk. Az oldatot -20 °C hőmérsékletre hűtjük. Állás közben fehér színű kristályos termékként az A 25822 N kikristályosodik. A terméket szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, amikor 39 mg 156-159 °C olvadáspontú anyagot kapunk. Acetonból kikristályosítva a termék olvadáspontja 165 °C. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, amikor olajos desztillációs maradékot kapunk. Ezt kloroformban oldjuk, az oldatot 1,0X25 cm méretű bázikus alumínium-oxid oszlopon kromatografáljuk. Az alumínium-oxidot előzőleg desztillált vízzel kezeljük (dezaktiválás), majd kloroformmal mossuk. A dezaktiválásból és a mosásból származó eluátumokat kiontjuk. A hatóanyagot kloroformmal eluáljuk az oszlopról, 10—10 ml térfogatú frakciókat szedve. A 18-31. frakciókat egyesítjük, az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, amikor desztillációs maradékként olajos terméket kapunk. Ezt benzolban oldjuk, az oldatot liofilizáljuk, amikor 334 mg A 25822 M antibiotikumot kapunk. A termék egy amorf anyag, 140 °C hőmérsékleten bomlás közben olvad. Az A és L komponenseket tartalmazó termék (1. 5. táblázat II) 6 g-ját 100 ml acetonban oldjuk. Az oldat hőmérsékletét 4 C°-ra hűtjük, amikor állás közben az A antibiotikum kikristályosodik. A kristályokat szűréssel elkülönítjük, meleg acetonból kikristályosítjuk, amikor 1,78 g, 147 °C olvadáspontú A 25822 A-t kapunk. Az első szűrésből származó szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, amikor desztillációs maradékként olajos maradékot kapunk. Ezt kloroformban oldjuk, az oldatot 1,7X58 cm méretű szilikagél (Woelm Dry Column Grade, Activity 111/30 mm, Alupharm Chemicals, New Orleans, La.) oszlopon kromatografáljuk. A szilikagélt száraz állapotban töltjük az oszlopba. Az eluálást kloroformmal végezzük; az A és L antibiotikumokra jellemző, az ultraibolya spektrum 254 mju-os hullámhosszában mérhető elnyelési maximumot használjuk fel az eluátum antibiotikumtartalmának meghatározására. Miután az oszlopot térfogata 2,3-szorosának megfelelő kloroformmal eluáljuk, megállapítjuk, hogy az L antibiotikumot az oszlop térfogatának megfelelő térfogatú kloroformos frakció tartalmazza. Ezt csökkentett nyomáson bepároljuk, amikor desztillációs maradékként 0,191 g 20 C°-on olvadó amorf A 25822 L-t kapunk. A B és H antibiotikumokat tartalmazó termék (1. 5. táblázat II) 8 g-ját kloroformban oldjuk. Az oldatot 6,2 X 12 cm méretű, dezaktivált bázikus alumínium-oxiddal töltött kromatografáló oszlopra 5 engedjük. Az eluálást kloroformmal végezzük és 20 ml térfogatú frakciókat szedünk. A B komponenst a 10—40. frakcióban találjuk, ezeket egyesítjük. A H antibiotikum a 81-210. frakciókkal eluálódik, ezeket szintén egyesítjük. Az antibiotikum jelenlétét az 10 e gy es frakciókban vékonyréteg-kromatográfiával és gáz-fölyadék kromatográfiával bizonyítjuk. A H komponenst tartalmazó oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, amikor desztillációs maradékként olajos terméket kapunk. Ezt 4 ml acetonban .oldjuk, az 15 oldatot 6 preparatív vékonyréteg-kromatográfiás lemezre cseppentjük. A vékonyrétegek E. Merck gyártmányok, 20X20 cm méretűek, F 254, 2,0 mm vastagon szilikagéllel (Brinkmann Instruments, Inc., Westburry. N. Y.) bevont üveglapok. A futtatást 20 dietiléter és etanol 3:1 arányú elegyével végezzük. Azokon a helyeken, ahol a szilikagél H komponenst tartalmaz, lekaparjuk a réteget és egyesítjük az anyagot, levegőn szárítjuk, majd 6,2X3 cm méretű, szilikagéllel (Grade 62, 60-200 Mesh, Metheson, 25 Colimán and Bell Notwood, Ohio) töltött kromatografáló oszlopra engedjük. Az oszlopot előzőleg etilacetáttal mosott szilikagéllel töltjük. Az eluálást 1 liter etilacetáttal végezzük. Az eluátumot csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor desztillációs maradék-30 ként 0,146 g A 25822 H-t kapunk. A termék amorf. 74—77 °C olvadáspontú anyag. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint a D antibiotikumot tartalmazó termék (1. 5. táblázat V) 2,5 g-nyi mennyiségét kloroformban oldjuk. Az olda-35 tot 4,6X56 cm méretű, szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. A szilikagélt előzőleg kloroformmal mostuk. Az eluálást olyan kloroform-metanol eleggyel végezzük, amelynek metanoltartalmát egyenletesen 0—40%-ig növeljük. 20 ml térfogatú frakció-40 kat szedünk. A D antibiotikumot a 135—170. frakciók tartalmazzák. Ezt vékonyréteg-kromatográfiával és gáz-folyadék kromatográfiával bizonyítjuk. A 135—170. frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. Desztillációs maradékként 0,818 g, amorf, 51-55 °C olvadáspontú A 25822 D-t kapunk. 45 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az I általános képletű — ahol R1 és R 2 50 jelentése egyaránt hidrogénatom vagy egyaránt metilcsoport, és ahol R3 hidroxil vagy acetoxicsoport -, a III képletű, valamint a D, H és L jelzésű A 25822 antibiotikumfaktorok, illetve ezek gyógyászatilag alkalmazható savaddíciós sói előállítására, azzal jelle-55 mezve, hogy a Geotrichum flavo-brunneum NRRL 3862 törzset (letétbe helyezve az Argicultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, Department of Agriculture, Peoria, Illinois törzsgyűjteményében NRRL 3862 60 szám alatt) asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett aerob fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd a fermentleben jelenlevő antibiotikum-faktor elegyet elkülönítjük és az elegyből elválasztjuk az 65 egyes faktorokat, és kívánt esetben egy kapott vegyü-9
