167919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-25822 jelű antibiotikum- komplex komponensei előállítására

13 167919 14 esetben a nagy űrtartalmú fermentorban gyorsabban indul meg a növekedés, mint ha közvetlenül ferdeagarról nyert spóraszuszpenzióval oltanánk. A vegetatív inokulummal elérhető gyors növekedés mind a termelés, mind a fermentorkapacitás növelése és a ter- 5 mék előállításának összideje szempontjából előnyös. Az A 25822 jelű antibiotikumokat termelő törzs 25 °C és 35 °C közötti hőmérsékleten növekszik a legjobban. Az antibiotikumtermelés szempontjából előnyösen 25 °C és 28 °C közötti hőmérsékleten 10 fermentálunk. Mint más süllyesztett, aerob tenyésztéseknél, jelen esetben is, a fermentáció teljes ideje alatt steril levegőt buborékoltatunk át a táptalajon. Az organizmus jó növekedése és a magas hatóanyag-koncentráció 15 elérése érdekében percenként a táptalaj-térfogat 1/10 részénél több levegőt áramoltatunk át a fermentoron. Az A 25822 jelű antibiotikumok süllyesztett, aerob fermentációs körülmények közötti előállításakor a legmagasabb hatóanyag-tartalom elérése érdekében 20 előnyösen percenként a táptalajtérfogat legalább 3/10 részének megfelelő levegőt buborékoltatunk át a készüléken. A legmagasabb hatóanyagkoncentrációt rázott tenyészetben és süllyesztett, levegőztetett fermentáció 2.c esetén általában az oltást követő harmadik és hatodik nap között mérjük. Nagyméretű fermentorokban, süllyesztett aerob fermentációs körülmények között körülbelül a 72. órában mérjük a legmagasabb hatóanyag-tartalmat. Ha felületi tenyésztést folytatunk, 30 csak hosszú idő eltelte után tapasztaljuk a hatóanyag megjelenését a táptalajban. A fermentáció során a tenyészlé hatóanyagtartalmát, adott időpontokban, az A 25822 antibiotikumokkal szemben érzékeny organizmusokkal, bioló- 35 giai értékméréssel határozzuk meg. Ilyen organizmus például a Candida tropicalis és a Trichophyton mentagrophytes. A süllyesztett, aerob fermentációs körülmények között végzett fermentációt követően az előzőekben 40 ismertetett A 25 822 antibiotikumkeverék a fermentációs iparban általánosan ismert módszerekkel különíthető el a tenyészléből. A jelenlevő antibiotikum (aktivitás) nagyrésze a micéliumhoz kötött. A szűrt tenyészlé viszonylag alacsony antibiotikum- 45 tartalmú. Például egy 1000 literes fermentorból nyert tenyészlében az összaktivitás 90%-át a micéliumon, míg 10%-át a szűrt létben mértük. Az előzőekben leírt és jellemzett NRRL 3862 számú törzs a fent megadott körülmények között 50 olyan antibiotikumkeveréket termel, amelynek túlnyomó része a B komponensből áll. A teljes antibiotikum-aktivitás 80—90%-áért a B komponens a felelős. A többi összetevő felelős a fentmaradó mérhető aktivitás gyakorlatilag teljes egészéért. 55 Az A 25822 antibiotikumokat mint az egyes antibiotikumok keverékét különítjük el a tenyészléből. Mivel a keletkezett antibiotikumok nagyrésze a micéliumhoz kötött, a tenyészlevet szűrjük és a micéliumot előnyös szerves oldószerrel extraháljuk. 60 Az extrakcióhoz kisszénatomszámú alkoholokat, például metanolt, etanolt vagy izopropanolt, észtereket, például etilacetátot, amilacetátot vagy izoamilacetátot használhatunk'. A legelőnyösebb extrakciós oldószer az etilacetát. °5 Az extraktumot vízmentesítés után szárazra pároljuk, amikor megkapjuk a nyers antibiotikumkeveréket. Ugy is eljárhatunk, hogy az egész tenyészlevet extraháljuk egy előnyös tulajdonságú szerves oldószerrel (vízzel nem elegyedő oldószerrel), például etilacetáttal, majd szűrés után az extraktumot az antibiotikum elkülönítésére a fentiek szerint kezeljük. Az A 25822 jelű antibiotikumok nyers keverékét vagy a keverék szerves oldószeres oldatának savas és bázikus oldószeres mosásával, vagy előnyös adszorbensben, például alumínium-oxidon vagy szilikagélen kromatografálva tisztíthatjuk. A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint az egész tenyészlevet extraháljuk. Úgy járunk el, hogy az egész tenyészlevet előnyös szerves oldószerrel, például etilacetáttal vagy amilacetáttal extraháljuk és az extraktumot a szennyezőanyagok eltávolítására mossuk. Az extraktum mosását savas pH-jú vízzel is végezhetjük, ebben az esetben a bázikus antibiotikumok savaddíciós sókként különülnek el. Ezután a savas, vizes mosófolyadék pH-ját egy bázissal, például nátrium-hidroxiddal lúgosra állítjuk be és a hatóanyagot szerves oldószerrel, például etilacetáttal vagy dietiléterrel extraháljuk. Ezután a szerves oldószeres extraktumot mossuk, vízmentesítjük és szárazra pároljuk, amikor desztillációs maradékként megkapjuk a tiszta antibiotikumkeveréket. Az antibiotikumkeverék összetevőit az ismert kromatográfiás eljárásokkal egymástól elválaszthatjuk. A kromatografálást például alumínium-oxidból vagy szilikagélből készült oszloppal végezhetjük. Az egyes antibiotikumokat frakcionált kristályosítással is elkülöníthetjük egymástól. Az antibiotikumkeveréket alkotó antibiotikumok nagy száma és ezek igen hasonló szerkezete miatt elkülönítésükkor a kromatográfiás és a frakcionált kristályosítási eljárást együttesen használjuk. A legnagyobb mennyiségben jelenlevő B komponenst különíthetjük el a legkönnyebben. A többi, a keverékben még jelenlevő kisebb mennyiségű komponenst nehezebb egymástól elkülöníteni. A B vegyület kristályos alakban például úgy különíthető el, hogy a lehető legkisebb mennyiségű acetonban vagy etilacetátban oldjuk az antibiotikumkeveréket, a. tömény oldatot nagymennyiségű hexánnal hígítjuk, majd a B komponens túlnyomó részének kikristályosítására —20 °C és —5 °C közötti hőmérsékletre hűtjük az oldatot. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és újra kikristályosítjuk. A szűrletet száraz desztillációs maradékig desztilláljuk, így megkapjuk a további összetevőket és egy kismennyiségű B komponenst tartalmazó keveréket. Ezt alumínium-oxid oszlopon kromatografáljuk; a gradiens eluálást például etilacetát, hexán és víz elegyével végezzük. Az egyes eluátumokat ismételt kromatográfiával és frakcionált kristályosítással tovább tisztítjuk, így megkapjuk az egyes, kis mennyiségben jelenlevő komponenseket. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük. 1. példa Az A 25822 jelű antibiotikumok keverékét a találmány szerint eljárva a következő módon állítjuk elő. 7