167714. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glicerinkináz kinyerésére mikroorganizmusokból

167714 4. Lépés ml Aktivitás Kitermelés, % Megjegyzés Protaminszulfátos oldat az erjesztéses feltárás Az 1 238 422 sz. DAS szerint + után 2500 1,4 • 104 100 protaminszulfát + DEAE-Sephadex-es lépés EíuátumDEAE-Sephadex-ről 224 8,2 • 103 60 Oldat 60 C°-os hőkezelés után 202 3,96 • 103 28 Az ammóniumszulfátos csapadék feloldva 20 4,14 • 103 29 Dializátum 21 3,22 • 103 23 Eluátum DEAE-Sephadex-ről 235 3,20 • 103 22 A kitermelések a protaminszulfátos oldatra vonatkoznak 5. Lépés ml Aktivitás melés, % Megjegyzés Nagynyomású diszpergálás 420 3,2 • 102 100 Hasonlóan a találmány szerinti eljáráshoz de anioncserélős lépés nélkül Protaminszulfát 440 3,02 • 102 95 Hőkezelés 440 2,62 • 102 82 Ammóniumszulfátos csapadék feloldva 20 2,72 • 102 85 Dializátum 24,5 1,81 • 102 56 3. példa (összehasonlító kísérlet) A találmány szerinti eljárást összehasonlítottuk a J. of Biol. Dhem. 242, (5) 1030. oldalán leírt sztreptomicin- 30 -szulfátos lépéssel, melyet ez esetben a találmány szerinti eljárás protaminszulfátos lépése helyett alkalmazunk. E kísérletnél is az 1. példában leírt Candida-ból indultunk ki, melyet nagynyomású diszpergálással feltártunk, majd elvégeztük a protaminszulfátos lecsapást, a DEAE- 35 -Spehadexes lépést, és a hőkezelést (60 C°-on 60 percen keresztül). Ilyen módon lényegesen nehezebb körülmények között is a hőkezelés után még az eredeti aktivitás 36%-át értük el. Tekintettel arra, hogy az előző anioncserélős lépés végén a kitermelés még 72%-os volt, nyil- 40 vánvaló, hogy a hőkezelési lépés során a megmaradt aktivitás 50%-ra romlott le. Megismételtük ugyanezt a munkamenetet, de a protaminszulfátos lépés helyett beiktattunk egy sztreptomicinszulfátos lecsapást. Az ezt követő anioncserélős lépésnél 45 négyszeres mennyiségű ioncserélőre volt szükség, mint a találmány szerinti eljárásnál. Az ioncserélőről eluált oldat az eredeti aktivitás 54%-át mutatta. Az ezt követő hőkezelés során azonban ez az enzimaktivitás teljesen tönkrement. 50 4. példa 1. Feltárás: 55 300 g Oospora lactis tenyészetet foszfátpufferrel pH 7,0-ra állítunk be, feltöltjük 5 l-re és keveréssel homogenizáljuk. Az így előállított sejt-szuszpenziót nagy nyomáson diszpergálva feltárjuk, majd hideg sómentes vízzel 10 l-re 60 hígítjuk. 2. Protaminszulfátos lecsapás A 20—40 mg/ml szilárd anyagot tartalmazó enzimszuszpenzióhoz pH 7,0-ra beállított protaminszulfát oldatot adunk (c = 10 mg/ml), míg további zavarosodás 65 a hozzáadásnál már nem észlelhető. Rövid keverés után a csapadékot centrifugálással, vagy szűréssel elválasztjuk. 3. Anioncserélő-gyantával való kezelés Az előállított enzimoldathoz előzetes kísérlet után olyan mennyiségű pH 7,0-ra beállított, sómentes, kimosott DEAE-Sephadex ioncserélőt adunk, amennyi elegendő ahhoz, hogy az ioncserélő fölötti oldatban glicerin-kinázne legyen már kimutatható. Az ioncserélőt szűréssel elválasztjuk és a szűrletet elöntjük. A szűrőpogácsát háromszoros térfogatú pufferoldattal (0,025 mól káliumfoszfát és 0,1 mól nátriumklorid, pH 7,0) 20 percen keresztül keverjük. A 20 perces keverés után szűrünk, a szűrletet eleresztjük. A glicerin-kinázt 0,05 mólos pH 7,0 káliumfoszfát pufferrel — amely nátriumkloridra 0,3 mólos — eluáljuk. Az egyesített eluátumok tartalmazzák az eredeti aktivitás 72%-át. Az oldathoz annak betöményítésére 3,2 mól végkoncentrációig ammóniumszulfátot adunk. Ekkor lecentrifugáljuk, és a szűrletet elöntjük. 4. Felmelegítés Az ammóniumszulfátos lecsapásnál nyert csapadékot 0,05 mólos káliumszulfát pufferrel felvesszük és ammóniumszulfátot adunk hozzá, amíg az oldat ammóniumszulfátra 1,0 mólos lesz. Ezután az oldatot 10 percig 59 C°-on tartjuk, gyorsan lehűtjük + 10 C°-ra, lecentrifugáljuk és a csapadékot eldobjuk. 5. Ammóniumszulfátos frakcionálás Az előzőek szerint előállított oldathoz 3,2 mólos végkoncentrációig ammóniumszulfátot adunk. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 2,05 mólos ammóniumszulfátoldatban újra szuszpendáljuk és ismét centrifugáljuk. A szűrletet elöntjük és a csapadékot 0,02 mólos káliumfoszfátpufferoldatban (pH 6,5) felvesszük. A felmelegítést az előzőekben leírt módon megismételjük. Az oldathoz ezután 3,2 mól végkoncentrációig ammóniumszulfátot adunk, ekkor a kívánt csapadékot lecentrifugáljuk. 6. Dialízis és kromatografálás 4