167714. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glicerinkináz kinyerésére mikroorganizmusokból

lyenkor a glicerinkináz nem csapódik ki, további protaminszulfát-oldatot adagolunk egészen addig, míg újabb protaminszulfát hozzáadásánál már nem lép fel észrevehető zavarosodás. A levált csapadékot bármelyik megfelelő módszerrel el lehet választani, pl. szűréssel vagy centrifugálással. A szűrőpogácsát célszerű kimosni és a mosóvizet hozzáadni a szűrlethez. Az így kapott szűrleteket egyesítjük és cellulóz- vagy dextrán-bázisú anioncserélővel tetszés szerinti módon kezeljük. Előnyösnek találtuk a DEAE-Sephadex (dextrán-alapú ioncserélő) és a DEAE-cellulóz alkalmazását. A kezelés történhet oszlopon vagy szakaszosan. A szakaszos munkamenet az előnyösebb, mert egyszerűbben kivitelezhető, mivel ez esetben az anioncserélőt közvetlenül hozzákeverjük az enzimoldathoz. Előkísérlettel könnyen meg lehet állapítani, hogy milyen mennyiség szükséges az ioncserélő gyantából, mivel a glicerinkináz az ioncserélő gyantára kötődik. Mindig annyi anioncserélő gyantát kell alkalmazni, hogy a gyanta felett levő oldathoz ne maradjon kimutatható menynyiségű glicerinkináz. A DEAE-cellulóznak glicerinkináznál való alkalmazása önmagában ismert és a leírt eluálási eljárások alkalmazása is önmagában ismert és a leírt eluálási eljárások is alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásnál. Az eljárás kivitele szempontjából lényeges az, hogy az egyes lépéseket a megadott sorrendben, nagyobb megszakítások nélkül végezzük és a hőmérséklet 10 C° alatt, előnyösen 5 C° körül tartsuk. Az egyes eljárási lépéseknek a találmányunk szerinti kombinációjával meglepő módon olyan stabil készítményhez jutunk, melynek aktivitása nem csökken, mégha hosszú ideig is tárolják hidegben. A készítmény további tisztítása tetszés szerinti módon történhet, az ismert és bevált eljárások bármelyikével. A további tisztítást célszerűen az 1 238 422 sz. német szövetségi köztársaságbeli közzétételi iratban leírt eljárással végezzük. Ez esetben az eljárási lépéseknek a találmányunk szerinti kombinációját az ismert eljárás D-lépésével folytatjuk, a felhevítéssel és utána bármelyik ismert tisztítási lépést alkalmazhatjuk. Ha olyan készítménnyel dolgozunk, melyet a találmány szerint, az előzőekben leírt eljárással állítottunk elő, akkor azonos kiindulási anyagra számolva 300%kal nagyobb kitermelést érhetünk el, mint az említett közzétételi iratban leírt eljárással. Előnyösnek tartjuk azt a feldolgozási módot, melynél a találmány szerinti eljárással előállított terméket ammóniumszulfátos kicsapással betöményítjük, majd felmelegítjük 60 C°-ra, a csapadékot elválasztjuk és a szűrlethez annyi ammóniumszulfátot adunk, hogy az oldat 3,2 mólos legyen. Az ammóniumszulfát hozzáadására kiváló csapadékot az előzőekkel azonos módon felhevítjük, megtisztítjuk a denaturálódott fehérjétől és anioncserélő gyanta-oszlopon, célszerűen DEAE-Spehadex típusú oszlopon ismert módon kromatografáljuk. A kromatografált anyagot leoldjuk és ismert módon ammóniumszulfáttal kikristályosítjuk. A találmányunk szerinti eljárást a következő példákon mutatjuk be: 4 1. példa 1. Feltárás: 5 6 kg Candida mycoderma tenyészetet beállítunk 7,0 pH-értékű foszfát-pufferral, 100 l-re töltjük és keveréssel homogenizáljuk. Az így előállított sejt-szuszpenziót nagynyomású diszpergálással feltárjuk, majd hideg desztillált vízzel 200 l-re 10 hígítjuk. 2. Protaminszulfátos kicsapás A ml-ként 20—40 mg szilárd anyagot tartalmazó enzimszuszpenzióhoz pH 7,0-ra beállított protaminszulfát-oldatot adunk (c = 10 mg/ml), míg további hozzáadás-15 nál zavarosodás már nem észlelhető. Rövid ideig keverjük, majd a csapadékot centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk. 3. Anioncserélő-gyantával való kezelés Az így előállított enzimoldathoz pH 7,0-ra beállított 20 sómentesre mosott DEAE-Sephadex ioncserélőt adunk. A Sephadexből szükséges mennyiséget előkísérlettel állapítjuk meg; olyan mennyiséget alkalmazunk, hogy az ioncserélő fölötti oldatban glicerin-kináz ne legyen már kimutatható. Az ioncserélőt elválasztjuk és a szűrletet 25 elöntjük. A leszűrt szűrőpogácsát háromszoros térfogatú pufferoldattal (pufferoldat: 0,05 mól káliumfoszfát +0,1 mól nátriumklorid, pH 7,0) 20 percen keresztül keverjük. Keverés után szűrünk és a szűrletet elöntjük. A glicerin-kinázt ezután leoldjuk az ioncserélőről. Az eluáló oldat 30 0,05 mólos káliumfoszfát puffer (pH 7,0) és nátriumkloridra 0,3 mólos. Az egyesített eluátumok tartalmazzák az eredeti enzimaktivitás 72%-át. A specifikus aktivitás kb. 8 egységnek felel meg. 35 Az oldat betöményítésére 3,2 mól koncentrációig, majd lecentrifugáljuk és a szűrletet elöntjük. 4. Felmelegítés Az ammóniumszulfátos kicsapásnál elkülönített anyagot 0,05 mólos (pH 7,0) káliumfoszfát pufferrel felvesz-40 szűk és annyi ammóniumszulfátot adunk hozzá, míg az oldat ammóniumszulfátra 1 mólos lesz. Ezután az oldatot vízfürdőn 10 percen keresztül 59 C°-on tartjuk, gyorsan lehűtjük +10 C°-ra és lecentrifugáljuk. A csapadékot eldobjuk. 45 5. Ammóniumszulfátos frakcionálás Az előzőek szerint előállított oldathoz 3,2 mól végkoncentrációig ammóniumszulfátot adunk. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 2,05 mólos ammóniumszulfát oldatban szuszpendáljuk és újból centrifugáljuk. A szűr-50 letet elöntjük és a csapadékot felvesszük 0,02 mólos (pH 6,5) káliumfoszfát pufferben. A felmelegítést az előzőekben leírt módon megismételjük. Az oldathoz ezután 3,2 mól végkoncentrációig ammóniumszulfátot adunk és ekkor a kivált csapadékot lecentrifugáljuk. 55 6. Dialízis és kromatografálás A csapadékot 0,05 mólos (pH 7,0) káliumfoszfát pufferoldattal felvesszük és hűtött helyiségben ugyanilyen pufferoldattal szemben egy éjszakán át dializáljuk. A dializátumhoz annyi nátriumkloridot adunk, hogy az 0,1 60 mólos legyen és az oldatot DEAE-Sephadex oszlopra visszük fel. Az oszlopot pufferoldattal (0,05 mólos káliumfoszfát + 0,125 mólos nátriumklorid, pH 7,0) mossuk és a glicerin-kinázt eluáljuk a fenti pufferoldattal, mely azonban 0,2 mól nátriumkloridot tartalmaz. 65 Az eluátumhoz lassan, kis részletekben 2,4 mól vég-2