167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
15 167655 16 5. példa H-D- OSer-Tyr-Ser-Met- Glu-His-Phe-Arg - Trp-G ly-Lys-Pro-Val-G ly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-OH 0,600 g (0,1.42 mmol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-(OBuVHis-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys-(BOC)-Lys • (BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(W}-Pro-Ásp -(OBuVAla-Gly-GluíOBuVOBUTa HCL-ot feloldunk 4,8 ml triflúorecetsav, 0,6 ml víz és 0,6 ml anizol elegyében. Az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 60 ml éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. 0,533 g (86,5%) aminooxikarbönsawal helyettesített oktakozapeptid-trifiuoracetátot kapunk. A nyers trifiuoracetátot 10 ml vízben oldjuk, a trifluoracetát ionokat acetát ciklusú Dowex 1x8 ioncserélő gyantával acetát ionokra cseréljük. Az így kapott helyettesített oktakozapeptid-acetát oldatot Whatman—CM—52 ioncserélőből készített 4,5x58 cm-es oszlopra öntjük, majd 2 liter 0,01 mólos (pH 4,5) és 2 liter 0,4 mólos (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készült lineáris puffergradienssel eluáljuk. A kívánt anyagot tartalmazó 95-109. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,250 g (43%) aminooxikarbönsawal helyettesített oktakozapeptidet kapunk; peptid tartalom: 81,0% (UV elnyelés alapján), Met-szulfoxid tartalom: 4,4% Tyr/Trp arány: 2,05, aminosavanallzis: Lys 3,76 (4), His 0,8 (1), Arg 3,05 (3), Asp 1,00 (1), Ser 0,73 (1), Glu 1,94 (2), Pro 3,00 (3), Gly 2,95 (3), Ala 1,05 (1), Val 2,82 (3), Met 0,78 (1), Tyr 1,6 (2), Phe 0,83(1).% =0,28. A kündulóanyagként használt védett, aminooxikarbönsawal helyettesített oktakozapeptid trihidrokloridot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: terc-Butiloxikarbonil-D- alfa-aminooxi-béta- benziloxipropionsav A 4. példa 1. lépésében nyert terc-butiloxikarbonil- D-alfa-aminooxi-béta- benziloxipropionsav-(+)amfetaminsót etanolból átkristályosítjuk. Kitermelés: 13,27 g, op.: 188-191 C°, [ag6 = + 54 9 (c = 0,5, metanol). A só megbontásával 7,9 g (14%) terc-buitiloxikarbonil- D-alfa- aminoxoi-béta- benziloxipropionsavat kapunk; op.: 96-98 C°, [afD ° = +38° (c = 1, etanol). 2. lépés: terc-Butiloxikarbonil- D-alfa-aminoxoi-béta- hidroxipropionsav (BOC-D-OSer-OH) 5,5 g (17,7 mmól) D-alfa-terc-butiloxikarbonilaminooxi-béta- benziloxipropionsavat feloldunk 110 ml metanolban és 2,76 g 10%-os csontszenes palládiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezzük. 3 óra múlva a katalizátort kiszűrjük és a metanol ledesztillálása után visszamaradó olajat petroléter alatt állni hagyjuk. Néhány óra alatt kristályosodik. Szűrés, szárítás után 3,65 g (96%) D-alfa-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-béta- hidroxipropionsavat kapunk; op.: 94-95 0°,]*/ = 0,27. 3. lépés: BOC-D- OSer-Tyr-Ser-Met-N2 H 3 4,4 g (20 mmól) BOC-D-OSer-OH-t és 9,0 g (20 mmól) H-Tyr-Ser-Met-OCH3 -ot feloldunk 30 ml 5 dimetilformamidban. Az oldatot 0 C°-ra hűtjük és hozzáadunk 2,22 ml (20 mmól) N-metilmorfolint, majd 3,8 go (18,4 mmól) DCC-t. A reakcióelegyet 1 Órán át 0 C°-on keverjük, majd másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a DCU-t kiszűrjük, a 10 szűrletet bepároljuk, a maradékot 400 ml etilacetátban oldjuk. Az oldatot 2x200 ml n sósawal, kétszer 200 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk, majd szárítás után bepároljuk. A maradékot (8,10 g; védett, aminooxikarbönsawal helyettesített 15 tetrapeptidészter) 85 ml metanolban feloldjuk, 2,2 ml (46 mmól) hidrazinhidrátot adunk hozzá és másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Másnap a metanolt ledesztilláljuk, a maradékot etilacetáttal eldörzsöljük, szűrjük, etilacetáttal, éterrel mossuk és tömény kén-20 sav mellett szárítjuk. 7,21 g (63%) védett, aminooxikarbönsawal helyettesitett tetrapeptid-hidrazidot kapunk; op.: 174-175 C° (vízből átkristályosítva), R/= 0,30. Elemzés a C2s H 4 oN 6 Oi 0 S összegképlet alapján: 25 számított: C 48,7%; H 6,55%; N 13,6%; talált:C 48,3%; H 6,6%; N 13,8%. 4. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser -Met-Glu (OBuVHis 30 -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)- Pro-Val-Gly-OH.HCI 1,25 g (2,13 mmól) BOC-D-OSer-Tyr -Ser-Met-N2 H 3 -ot feloldunk 15 ml dimetilformamid-_5 ban. A -20 C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 2,08 ml (8,32 mmól) 4 n etilacetátos sósavoldatot, majd 0,32 ml (2,70 mmól) terc-butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10 C-on keverjük, majd -20 C°-ra hűtjük és hozzáadjuk 2,78 gH-Glu 40 (OBu^-His-Phe-Arg- Trp-Gly-Lys (BOC)- Pro-Val-Gly-OH és 1,4 ml (8,13 mmól) diizopropil-etilamin 23 ml dimetilformamidos oldatát. A reakcióelegyet 1 órán át -5 és 0 C° közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 C°-on állni hagyjuk. 4g Ezután az oldatot bepároljuk és a maradékot 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattá eldörzsöljük. Szűrés, vizes mosás, szárítás után 3,49 g (94%) védett, aminooxikarbönsawal helyettesített tetradekapeptidet kapunk, 4,75 ml tömény sósav és 4,75 ml 59 piridin elegyítésével, piridin - hidroklorid oldatot készítünk, és hozzáadjuk a 24 ml metanolban szuszpendált védett, aminooxikarbönsawal helyettesített tetradekapeptidhez. Az így kapott oldatot 240 ml vízzel hígítjuk, a kivált csapadékot leszűrjük, vízzel 55 mossuk és szárítjuk. 2,95 g (73%) védett, aminooxikarbönsawal helyettesített tetradekapeptid-hidrokloridot kapunk; op.: 200-202 C° Rf2 = 0,25. 5. lépés 60 BOC-D-OSer- Tyr-Ser-Met-Glu (OBu^-His-Phe-Arg- Trp-Gly-Lys (BOC)-Pro-Val -G ly-Lys(BOC)- Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys (BOC)-Val -TyrlBu*) -Pro-AspfOBu*) - Ala - Gly-Glu (OBu^-OBu* 65 0,350 g (0,176 mmól) BOC-D-OSer-Tyr- Ser-Met-Glu (OBut) -His-Phe-Arg-Trp -Gly-Lys-
