167616. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusellenes hatású komplex előállítására

15 167616 16 élesztőkivonat (,

;Oxoid" védjegyzett készítmény) 1,0 g nyomelem-koncentrátum (lásd alább) 1,0 ml desztillált vízzel feltöltve 1 literre. A fent említett nyomelem-koncentrátumot az alábbi módon állítjuk elő: a következekben felsorolt anyagokat vas(II)-szulfát-heptahidrát 1,0 g réz(H)-szulfát-pentahidrát 0,15 g cink-szulfát-heptahidrát 1,0 g mangán-szulfát-tetrahidrát 0,1 g kálium-molibdát 0,1 g desztillált vízben oldjuk és az oldás során annyi tömény sósavat adunk a vizes közeghez, amennyi elegendő ahhoz, hogy tiszta oldatot kapjunk; végül az így kapott tiszta oldatot további desztillált vízzel 1 literre hígítjuk. A fenti módon előállított tápközeg pH-értékét vizes 10 n kálium-hidroxid-oldat hozzáadásával 5,8-ra állítjuk be, majd 0,67 atm túlnyomáson, autoklávban 25 percig sterilizáljuk. 90 darab Thompson-palackban, palackonként 1 liter tápközegben, felületi kultúrában, 25 °C hőmérsékleten Sirodesmium diversum C.M.I. 102519 mikroorganizmus-törzset tenyésztünk 35 napig. Ekkor a fermentációs levet leszűrjük; összesen 70 liter, 6,5 körüli pH-értékű szűrletet kapunk. Ezt 2 x 14 liter toluollal extraháljuk. Az egyesített toluolos kivonatot vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd 20 mmHg nyomáson, 60 °C hőmérsékleten bepároljuk. 7,1 g maradékot kapunk, ezt 4 x 25 ml 60-80 °C forráspont-tartományú petroléterrel mossuk. A mosófolyadékokat kiselejtezzük; a mosott maradék alakjában kapjuk a komplex vírusellenes szert. 2. példa Az 1. példa szerinti eljárás kétszeri lefolytatása és a kapott termékek egyesítése útján előállított összesen 6,52 g komplex vírusellenes szert két egyenlő részre osztjuk. Mindegyik részt külön frakcionáljuk száraz-oszlopos kromatográfiával; az oszlopokat a következő módon készítjük elő: Két kétliteres lombikba beviszünk lombikonként 900 g szilikagélt (a Hopkins an Williams Ltd. „Silica Gel M.F.C." elnevezésű készítménye) és 100 ml vizet, majd a lombikot tartalmával együtt forgatókészülékben 2 óra hosszat forgatjuk szobahőmérsékleten. Ezután mindegyik lombikba beadagolunk 115 ml 3:2 arányú éter-etilacetátelegyet és a lombikokat további 3 óra hosszat forgatjuk. Végül az így kezelt szilikagélt (lombikonként külön-külön) egy-egy megfelelő méretű nylon hüvelybe töltjük és így 90x4 cm méretű száraz szilikagél-oszlopokat kapunk. A fenti módon elkészített oszlopok felső részére beadagoljuk a szétválasztandó komplex hatóanyagot, az éppen szükséges minimális mennyiségű 3:2 arányú éter-etilacetát-elegyben oldva, majd ugyanezt az oldószer-elegyet adagoljuk az oszlopra mindaddig, míg az oldószer-front el nem éri az oszlop alsó végét. Mindkét oszlopot ezután hat egyenlő térfogatú részre bontjuk; a két oszlopból kapott, azonos részeket egyesítjük és az így kapott 6 frakciót külön-külön eluáljuk 3 x 500 ml 97:3 arányú etilacetát-metanol eleggyel. Az egyes eluátumok bepárlása útján 6 frakciót kapunk; az 1. frakció a legkisebb polaritást, a 6. frakció pedig a legnagyobb polaritást mutatja. Az 1.—3, frakciót kiselejtezzük; a 4. frakció A- és C-szirodezmint tartalmaz, kevésbé poláros anyagok kíséretében; az 5. frakció nem egészen tiszta A-, B- és C-szirodezmint tartalmaz; a 6. frakció nem egészen 5 tiszta A-szirodezmint tartalmaz. A 4.-6. frakciót további szétválasztás céljából preparatív vékonyréteg-kromatográfiának vetjük alá: A 4. frakció két fő-komponenst (A- és C-szirodezmin), a 6. frakció egy főkomponenst (A-szirodezmin), 10 míg az 5. frakció három főkomponenst (A-, B- és C-szirodezmin) tartalmaz. A fenti frakciók vékonyréteg-kromatográfiás szétválasztásakor a főkomponensek számától függően 2, 1, illetve 3 fősávot adnak a vékonyréteg-kromatográfiás lemezen. A lemezek elu-15 álását 97:3 arányú étilacetát-metanol eleggyel végezzük el önmagában ismert módon. 20 x 40 0,1 cm méretű „G;F." szilikagél-lemezeken. Kétféle oldószerrendszert alkalmazunk futtatásra: az I. oldószer-rendszer etilacetát és toluol 2:1 arányú elegyéből, a II. 20 oldószer-rendszer hangyasav, metanol és kloroform 1:4:95 arányú elegyéből áll. Az elkülönített anyagot a megfelelő sávnak 97:3 arányú etilacetát-metanol eleggyel történő eluálása útján nyerjük ki. _,. A száraz oszlopos kromatográfiai elválasztás 4. frakciójából kapott 780 mg anyag további vékonyréteg-kromatográfiai elválasztása (8 lemezzel, az I. oldószer-rendszerrel) útján 1. frakcióként 92 mg, főleg A-szirodezminből álló terméket, 2. frakcióként __ pedig 156 mg, főleg A- és C-szirodezminből álló terméket kapunk. Az 1. frakció további vékonyrétegkromatográfiai szétválasztása (1 lemezen, kétszer futtatva a II. oldószer-rendszerrel) útján 3. frakcióként 43 mg A-szirodezmint kapunk. A 2. frakció további vékonyréteg-kromatográfiai szétválasztásával (2 le•" mezen, kétszer futtatva, a II. oldószer-rendszerrel) 4. frakcióként 36,4 mg terméket (A-szirodezmüij C-szirodezmin nyomai kíséretében) és 5. frakcióként 65 mg terméket (C-szirodezmin, A- és B-szirodezmin _ gyenge nyomaival szennyezve) kapunk. A száraz oszlop-kromatografálással kapott 5. frakció (716 mg) vékonyréteg-kromatográfiai szétválasztásával (8 lemezen, I. oldószer-rendszerrel) 6. frakcióként 296 mg, túlnyomórészt A- és C-szirodezmin-45 bői álló terméket kapunk; ezt további szétválasztásnak vetjük alá (6 lemezen, a II. oldószer-rendszerrel) és így 7. frakcióként 63,4 mg, főként A-szirodezminből álló terméket, 8. frakcióként pedig 146 mg, főként C-szirodezminből álló terméket kapunk. A 50 vékonyréteg-kromatográfiai szétválasztás során kapott 4. és 7. frakciót egyesítjük és újbóli vékonyréteg-kromatográfiai szétválasztásnak vetjük alá (2 lemezen, kétszer futtatva, a II. oldószer-rendszerrel), így 9. frakcióként 37 mg A-szirodezmint kapunk. A vékony-55 réteg-kromatográfiai szétválasztással kapott 3. és 9. frakciót egyesítjük, 2 ml benzolban oldjuk, az oldathoz 60-80 °C forráspont-tartományú petrolétert csepegtetünk keverés közben és így szilárd alakban leválasztjuk az A-szirodezmint (68 mg tiszta terméket 60 kapunk). A vékonyréteg-kromatográfiai szétválasztással kapott 8. frakciót további vékonyréteg-kromatográfiai szétválasztásnak vetjük alá (1 lemezen, kétszer futtat-65 va, a II. oldószerrendszerrel), így 10. frakcióként 68 mg C-szirodezmint kapunk, az A- és B-szirodezmin gyenge nyomaival szennyezett alakban. 8