167605. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozóanyag előállítására fehérjék számára

5 167605 6 10 percen át rázogatjuk, majd a felső réteget dekantáljuk. A maradékot jéghideg vízzel többször mossuk. Az aktivált részecskéket enzim-megkötésre használjuk fel. 6. példa 1 g kromatográfiás célokra alkalmas poliamidot (Woetm-Eschwege) az 5. példában leírt módon aktiválunk. 7. példa 1 g porózus üveget (Corning Glass, részecskenagyság 120-200 mesh, pórusnagyság 1200 Á) az 5. példában leírt módon aktiválunk. 8. példa 1 g porózus üveget (lásd 7. példa) 300 mg 1,3-fenfléndiamin és 10 ml vízmentes benzol oldatához adunk és vízfürdőn 80 C°-on időnkénti kevergetés mellett melegítjük. Az üvegrészecskéket a benzolszag eltűnéséig vákuumban leszívatjuk, majd 20 ml jéghideg vízhez adjuk. Rázogatás közben előbb 300 mg nátriumnitritet adunk hozzá, majd a pH-t híg 20 térfogat %-os sósavval 1—2-re állítjuk be. Az elegyet 10 percen át rázogatjuk, a vörös felső részt dekantáljúk és a részecskéket jéghideg vízzel addig mossuk, míg a dekantálással elkülönített felső rész színtelenné válik. A vörösszínű üvegrészecskéket enzim-megkötésre használjuk fel. 9. példa 1 g 1,3-feniléndiaminnal aktivált porózus üvegrészecskéket (8. példa) naringináz-oldathoz (2 mg fehérje — Lowry - 25 ml jéghideg 0,05 mólos 6,5 pH-jú foszfát-pufferben) adunk és 1 órán át 4 C°-on óvatosan rázogatjuk. A részecskéket leszűrjük és 1 mólos káliumklorid-oldattal és a pufferrel mossuk. A porózus üvegrészecskéken megkötött naxingináz aktivitása 5,5 egység/g üveg (mérést a naringinből felszabadított cukormennyiség meghatározásával Borel és tsai módszerével végezzük el). 10 15 20 25 30 35 40 45 10. példa 1 g porózus üveget (Corning Glass, részecskenagyság 120-200 mesh, pórusnagyság 1200 Á) 200 mg transz-4,4'-diamino-sztilbén és 10 ml dioxán oldatához adunk és a 8. példában leírt módon aktiválunk. 11. példa 1 g, a 10. példa szerint aktivált hordozóanyagot 2 mg heszperidináz és 25 ml jéghideg 6,5 pH-jú foszfátpuffer oldatához adunk és 4 C°-on 1 órán át óvatosan rázogatunk. A szemcséket szűrjük és 1 mólos káliumklorid-oldattal és a pufferrel mossuk. A porózus üvegen megkötött heszperidináz aktivitása 1,9 egység/g üveg (heszperidin-dihidrokalkon szubsztrátumon mérve). 12. példa 1 g kromatográfiás célokra alkalmas szilikagélt 200 mg 1,3-feniléndiamin és 10 ml vízmentes benzol oldatához adunk. Az elegyet 5 percen át időnkénti rázogatás közben vízfürdőn (80 C°) melegítjük, majd a benzol teljes eltávolításáig vákuumban leszívatjuk. A maradékot 20 ml jéghideg vízhez adjuk, majd keverés közben előbb 300 mg nátriumnitritet adunk hozzá és utána a pH-t híg, 20 térfogat %-os sósavval 1-2-re állítjuk be. Az elegyet 10 percen át 0 C°-on keverjük, majd a pH-t 1 n nátriumhidroxid-oldattal 5-re állítjuk be és a felső részt dekantáljuk. A sötétibolya színű részecskéket sósavval pH 4-5 értékre savanyított vízzel addig mossuk míg a dekantáláskor kapott oldat színtelenné válik. Az ily módon aktivált részecskéket közvetlenül használjuk fel enzimmegkötésre. 13. példa A 12. példa szerint előkészített részecskéket (kb. 1 g) 40 mg naringináz-enzim és 20 ml 0,05 mólos 6,5 pH-jú foszfát-puffer oldatához adunk és egy éjjelen át 4 C -on lassú keverés közben inkubáljuk. A részecskéket szűrjük és előbb 1 mólos káliumkloridoldattal, majd a fenti pufferrel mossuk. A megkötött naringináz aktivitása 4,15 egység/g, ami a felhasznált oldható enzim 41,5%-ának felel meg. Táblázat Enzim Bemért enzim mg fehérje -mennyiség Aktivitás pro g hordozó egység egységek Szubsztrátum Hordozó alap: alumíniumoxid Naringináz Amiloglükozidáz 2 4 6,4 2,1 200 45 heszperidin-di hidrokalkon keményítő Hordozó alap: cellulóz (gyapot) Naringináz Heszperidináz 2 2 6,4 2,14 10,4 1,9 naringtn heszperidin-dihidrokalkon 3