167540. lajstromszámú szabadalom • Eljárás linkomicin előállítására

23 167540 24 A) Fermentáció. A Streptomyces espinosus NRRL 3890 törzs kultúrájával beoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő, alábbi összetételű 100 ml steril tápközeget: glükóz-monohi drát „Pharmamedia"kereskedelmi elnevezésű gyapotmagliszt-készítmény (Traders Oil Mill Co.) vízvezetéki víz pH-érték sterilizálás után 25 g/liter 25 g/liter 100 ml-re 7,2 oszlopot azután 500 ml vízzel mossuk, az oszlopról lefolyó vizes mosófolyadékot („vizes mosófolyadék") ugyancsak félretesszük további frakcióként. Ezután 95%-os vizes metanollal eluáljuk az 5 oszlopot, 20 ml-es frakciókat fogunk fel. A fenti módon összegyűjtött frakciókat a szokásos biológiai módszerrel vizsgáljuk, érzékeny Sarcina lutea mikroorganizmussal, az alábbi táblázatban az egyes frakciók aktivitását a kioltási zóna átmérő-1° jében (mm) adjuk meg: Zóna, mm A beoltott kultúrákat a palackokban három napig inkubáltatjuk 28 C° hőmérsékleten, forgó rendszerű rázókészülékben. A fenti módon kapott inokulum-kult urával azután beoltjuk 500 ml-es Erlenmeyer fermentáló-palackok egy sorozatát, mindegyik palack 100 ml alábbi összetételű steril táptalajt tartalmaz: „Kaysoy" finomra őrölt zsírtalanított szójaliszt (Archer Daniels Midland Co.) 35 g/liter soványtej 10 g/liter Czapek-Dox-húskivonat (Difco Laboratories, Detroit) 10 g/liter kalcium-karbonát 3 g/liter „Ucon LB-625"' polialkilén-glikol habzásgátló (Union Carbide Co.) 20 ml/liter pH-érték sterilizálás után 7,2 Mindegyik palackba 5 ml inokulum-kultúrát adunk a 100 ml tápközeghez. Egyes palackokat 35 28 C° hőmérsékleten, másokat 45 C° hőmérsékleten inkubáltatunk percenként 250 fordulattal, 6 cm lökettel dolgozó rotációs rázókészülékben. Ugyanezt az eljárást megismételjük oly módon 40 is, hogy a fent említett NRRL 3890 törzs helyett a fentebb említett három különféle biotípust alkalmazzuk inokulum-kultúraként. Az így lefolytatott fermentációs kísérletek eredményeit a leírás elején, az I. táblázatban foglaltuk össze. 45 B) Az antibitotikum kinyerése. A fentebb leírt módon kapott fermentlevet, amelynek térfogata kb. 4 liter, diatómaföld-szűrő- 50 rétegen keresztül leszűrjük. A szűrőn maradt szilárd anyagot 1 liter vízzel utánamossuk és ezt a mosófolyadékot egyesítjük a szűrlettel. Az így kapott oldatot az alábbiakban „tiszta fermentlé" elnevezéssel fogjuk említeni. A szűrőn maradt 55 szilárd anyagot azután 700-700 ml metanollal kétszer eldörzsöljük és az így kapott metanolos kivonatot szűréssel elkülönítjük (az alábbiakban „metanolos kivonat"). 60 A tiszta fermentlevet egy 250 ml Amberlite XAD—2 gyantát tartalmazó oszlopon folyatjuk keresztül, percenként 25 ml áramoltatási sebességgel. Az oszlopról távozó folyadékot („lefolyó fermentlé") egyik frakcióként félretesszük. Az 65 15 20 25 30 tiszta fermentlé 38 lefolyó fermentlé 19 vizes mosófolyadék 20 Frakciók: 2. 16 4. 14 5. 14,5 6. 36 7. 49 8. 51 9. 52 10. 51 12. 47 14. 43 16. 40 19. 37 20. 34 25. 35 30. 29 35. 30 40. 27 45. 26 50. 24 55. 28 60. 24 65. 19 70. 11 75. — 80. 11,5 85. nyomok 90. nyomok 95. 0 100. 10 A fenti módon kapott frakciók közül a 6—60. frakciót egyesítjük. Az így kapott oldatot szárazra pároljuk, maradékként 3,5 g nyers linkomicin-készítményt kapunk, amelynek biológiai aktivitása 310 meg linkomicin/mg antibiotikum-koncentrációnak felel meg. Ezt az anyagot azután diklór-metánnal eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott diklór-metános kivonatot szárazra pároljuk és a maradékot acetonnal eldörzsöljük. Ismét leszűrjük és a szűrlethez étert adunk. Az ennek hatására képződő csapadékot szűréssel eltávolítjuk, a szűrlethez n metanolos hidrogén-klorid oldatot adunk. Ennek hatására színtelen kristályos termék alakjában leválik a linkomicin-hidroklorid. Az így kapott csapadékot szűréssel elkülönítjük és aceton-víz elegyből átkristályosítjuk, végtermékként tiszta kritályos linkomicin hidrokloridot kapunk. 12