167482. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polivalens bovin adenovírus vakcina előállítására
167482 5000 ml-es hasáb- vagy hengeres alakú üvegedényben előnyös készíteni. A jó vírusszaporodás érdekében célszerű előzőleg megvizsgált, ellenanyagmentes vérsavót alkalmazni a tápfolyadékban. A szövettenyészeteket keltethetjük stacioner módon, de nagyobb felületet nőnek be a sejtek, ha az üvegedényt a sejtszuszpenzió bemérésétől kezdve a keltetés egész ideje alatt óránként 5—20-szor, előnyösen 8—10-szer egyenletes sebességgel forgatjuk. Az összefüggő sejtréteg kialakulása után a tápfolyadékot új tápfolyadékra cseréljül ki. Uj tápfolyadékként célszerű 0,5% hidrolizált laktalbumint tartalmazó Hanks-oldatot alkalmazni, amely vérsavót már nem tartalmaz. A szövettenyészeteket ezután 1-2 ml vírussal beoltjuk, és 37 C° hőmérsékletű termosztátba helyezzük. A stacioner módon készített szövettenyészeteket a vírusszaporítás ideje alatt vagy stacioner módon tartjuk, vagy az előbbi módon forgatjuk, a forgatásos módszerrel előállított szövettenyészeteket azonban a vírusszaporítás ideje alatt feltétlenül szükséges forgatni. A vírussal oltott szövettenyészetek addig maradnak 37 C°-os keltetőszekrényben, amíg a sejtek több, mint 50%-a lekerekedik. Az. l-es típusú vírus 3—5 nap alatt, a 8-as típusú vírus 5-7 nap alatt szaporodik el ilyen mértékben a tenyészetekben. A beoltott szövettenyészeteket tartalmazó üvegedényeket ekkor a sejtek széntroncsolása céljából —20 C°-os hűtőbe helyezzük, aminek eredményeként a sejtben foglalt vírus a tápfolyadékba kilép. A fagyasztás után 1-2 óra múlva szobahőmérsékleten felolvasztjuk az anyagot, és a vírustartalmú tápfolyadékot a sejttörmelékkel együtt vírustípusonként külön-külön egy-egy nagy űrtartalmú edényben összegyűjtjük. Az összegyűjtött vírustartalmú anyag titerét típusonként a szokásos módon határozzuk meg (Laboratory Manual in Virology, The Ontario Department of Health, Ontario, 1968, 121. oldal). A centrifugálással sejtmentesített folyadékból 10-es léptékű hígitási sort készítünk, amelyből 0,1 ml-nyi mennyiségeket oltunk szövettenyészetekbe. A stacioner szövettenyészetekben az l-es típusú vírus titere legalább 10"4, a 8-as típusú vírusé 10 -3 , a stacioner módon készített, de a vírusszaporítás ideje alatt forgatott szövettenyészetekben az l-es típusú vírus titere legalább 10_4>s , a 8-as típusú vírusé 10_3,s , míg a sejtszuszpenzió bemérésétől kezdve forgatott szövettenyészetekben az l-es típusú vírus legalább 10~s , a 8-as típusú vírus 10 -4 titert ér el milliliterenként. Csak olyan vírusanyag használható vakcina-készítésre, amelynek az l-es típusú vírustitere legalább 10-4 , a 8-as típusú vírustitere pedig legalább 10-3 milliliterenként. A titer meghatározása után az l-es és a 8-as vírustípust tartalmazó két folyadékot egyenlő térfogatarányban összeöntjük, és az anyagot az edény enyhe rázásával összekeverjük. A vírustartalmú anyagot ezután formaiinnal inaktiváljuk. Tömény vizes formaldehid-oldatból 0,1-0,4%, előnyösen 0,3% mennyiséget adunk az anyaghoz, majd az edényt 24 órán át szobahőmérsékleten 20-24 C°-on, utána 7 napon át +4C°-os hűtőben tároljuk. Az. inaktivált vírussal oltott szövettenyészetekben vírusszaporodás nem észlelhető. Az inaktivált vírus vakcinaként használva már 5 megfelelően immunizálja az állatokat. Antigénhatása azonban jobb, ha még nagy adszorbeáló képességű anyagot, pl. alumíniumhidroxidot is adunk hozzá. 20 térfogat% mennyiségű alumíniumhidroxid gélnek az anyaghoz való hozzáadá-10 sával csapadékos vakcina készíthető. A polivalens bovin adenovirus vakcinának 2 ml-es adagja megfelelően immunizálja a szarvasmarhákat a bovin adenovírusok bármely típusa ellen. A vakcina a vemhes tehenekben is megindítja 15 az ellenanyagképzést, amely az újszülött borjakat passzív módon védi a betegségtől. A fogékony állományok fertőződése esetén a betegség által okozott, országos átlagban 20—30% mértékű borjú-elhullást a rendszeres vakcinázás 1-3%-ra, tehát 20 e gy nagyságrendnél nagyobb mértékben csökkenti. A külföldön forgalomba kerülő vakcina az adenovírusoknak csupán 3-as típusát tartalmazza, tehát a kórokozó adenovírusoknak csupán egyetlen típusa ellen nyújt védelmet, s így a gyakorlati igényeket 25 nem elégíti ki (Veterinary Record 1973, 92, 420-424). A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákban részletesen ismertetjük. 30 1. példa A bovin adenovírusok első alcsoportjába tartozó 35 l-es típusú, LH/68jelű vírustörzset stacioner módon 2000 ml-es Roux-palackban készített primer vagy szekunder borjúvesehámsejt-tenyészetre oltjuk, és a továbbiakban is stacioner módon keltetjük. A második alcsoportba tartozó 8-as típusú 40 Misk/67jelű vírustörzset hasonló módon készített borjúhere-, borjútüdő- vagy borjúpajzsmirigy-tenyészetekbe oltjuk be. A beoltott szövettenyészeteket a 3. naptól kezdve mikroszkóppal figyeljük, és azokat a tenyészeteket, amelyekben a sejtek 50%-a 45 lekerekedett, -20 C° hőmérsékletű térben tároljuk. Az l-es típusú vírus 3-5 nap alatt, a 8-as típusú vírus 5—7 nap alatt szaporodik el. A lefagyasztott anyagot szobahőmérsékleten felolvasztjuk, majd az azonos vírustípust tartalmazó palackok tartalmát 50 egy-egy 50 l-es edénybe öntjük. A centrifugálással sejtmentesített vírustartalmú anyagból 10-es léptékű hígitási sort készítünk, és az egyes hígításokból 0,1 ml mennyiségeket szövettenyészetekbe oltunk a vírustiter meghatározása céljából. Az l-es típusú 55 vírusnak legalább 10-4 , a 8-as típusú vírusnak legalább 10~3 titerrel kell rendelkeznie. A titer megállapítása után a vírustípusokat egyenlő térfogatarányban összekeverjük, majd az így kapott anyagkeverékhez 0,3 térfogat% tömény vizes form-60 aldehid-oldatot adunk. Az anyagot 24 órán át szobahőmérsékleten, majd további 7 napon át +4 C° hőmérsékleten tartjuk. Az inaktiválást szövettenyészetre oltással ellenőrizzük. Az inaktivált vírust 20—200 ml-es vakcinás üvegedényzetbe do-65 zírozzuk.
