167466. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirazolo [1,5-A]pirimidin- származékok előállítására
13 167466 14 forraljuk visszafolyató hűtő alkalmazásával, majd bepároljuk szárazra. A kapott szilárd maradékot 2Ó0 ml vízben oldjuk, az oldatot aktívszénnel derítjük, majd leszűrjük. A szűrletet tömény sósavval megsavanyítjuk, ennek hatására kiválik a 5 termék, ezt elkülönítjük és megszárítjuk. Ily módon 9,6g 3-fenil-pirazolo[l,5-a]pirimidin-7-olt (az elméleti hozam 69%-a) kapunk, amely 322-324 C°-on bomlás közben olvad. Ibolyántúli színkép: Amax (pH 1) 208 nm (e = 26 800), 273 nm (e=12 150), 15 Amax (pH 11) 225 nm (e = 11 000), 329 nm (e = 7 400), 294 nm (váll). Elemzési adatok a Ci2 H 9 N 3 0 képlet alapján: 20 számított: C = 68,3%, H = 4,26%, N = 19,9%, talált: C =68,1%, H =4,25%, 25 N = 20,2%. 12. példa 30 6-Karbetoxi-3-(m-tolil)-pirazolo[ 1,5-a]-pirimidin-7-ol előállítása 35 18,3 g (0,1 mól) 3-amino-4-(m-tolil)-pirazol és 21,6 g (0,1 mól) etoximetilén-malonsav-dietilészter 200 ml ecetsavval készített oldatát 3 óra hosszat forraljuk visszafolyató hűtő alkalmazásával. Kezdet ben tiszta oldatot kapunk, amelyből körülbelül 40 másfél órai forralás után megkezdődik a termék kicsapódása. 3 órai forralás után a reakcióelegyet szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni, és az eközben kivált terméket szűréssel elkülönítjük, metanollal mossuk, majd megszárítjuk. Az így kapott nyers 45 terméket dimetilformamid és víz elegyéből átkristályosítjuk. 18,6 g analitikai tisztaságú 6-karbetoxi-3-(m-tolil)-pirazolo[l ,5-a]pirimidin-7-olt (az elméleti hozam 63%-a) kapunk, amely 278-280 C°-on bomlás közben olvad. 50 Ibolyántúli színkép: Xmax (pH 1) 211 nm (e = 32 700), 55 292 nm (e=13 660), *max (pH 11) 227 nm (e = 17 800), 319 nm (e = 22 300). Elemzési adatok a Ci6 H ls N 3 03 képlet alapján: 60 számított: C = 64,6%, H =5,05%, N =14,12%, talált: C = 64,53%, H = 5,09%, N =14,11%. 65 13. példa 3-(m-Tolil)-pirazolo[ 1,5-a]pirimidin-7-ol előállítása 1 g 6-karbetoxi-3-(m-tolil)-pirazolo[l,5-a]pirimidin-7-ol 5 ml 40%-os kénsawal készített szuszpenzióját keverés közben 2,5 óra hosszat forraljuk visszafolyató hűtő alkalmazásával. Ezután az oldatot lehűtjük és beleöntjük 10 ml vízbe. A kapott szuszpenzióhoz 4 pH-érték eléréséig vizes nátriumhidroxid-oldatot adunk. Fehér színű szilárd termék válik ki, ezt szűréssel elkülönítjük, vízzel mossuk, majd dimetilformamid és víz elegyéből átkristályosítjuk. Ily módon analitikailag tiszta 3-(m-tolil)-pirazolo[l,5-a]pirimidin-7-olt kapunk, amely minden tekintetben azonos a 11. példa szerint kapott termékkel. 14. példa A találmány szerinti eljárással kapott vegyületek inhibitor-aktivitását oly módon határoztuk meg, hogy egy „Cary 15" regisztráló spektrofotométerrel, amely egy 0-0,1 optikai sűrűségű fokozatos szűrővel volt felszerelve, 290 nm állandó hullámhosszúságú fényben mértük a vizsgált oldat színkép-változásait. Az oldódás elősegítése céljából a találmány szerinti eljárással kapott vegyületeket spektrofotometriai tisztaságú dimetilszulfoxidban oldottuk, ez az oldószer jól oldja e vegyületeket, és nem gátolja az enzim-hatást. A dimetilszulfoxidban oldott vegyületet azután hozzáadjuk az inkubációs elegyhez, amely 150 mikrontól trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-HCl puffert (pH = 7,50) tartalmaz, 0,6 mikrontól etiléndiamin-tetraecetsav, 0,013 mikromól xantin és 20-40 meg xantinoxidáz enzim kíséretében, 3,0 ml térfogatra beállított elegyben. A xantinoxidáz enzimet a Worthington Biochemical Co. cég által előállított tisztított tej-xantinoxidáz készítmény alakjában alkalmaztuk, amelynek fajlagos aktivitása 0,29 E/mg fehérje volt. A meghatározás oly módon történt, hogy az említett összes alkotóanyagokat egy küvettában elegyítettük 25 C° hőmérsékleten, majd az enzim keverőberendezés útján történő hozzáadásával megindítottuk a reakciót. Néhány percen át mértük az optikai sűrűség változását, majd kiszámítottuk az első 15 mp tartamára az optikai sűrűség percenkinti változásának sebességét a színkép-változások alapján. A vizsgált vegyületet inhibitor-aktivitásának teljes értékelése és az egyes vegyületek inhibitor-aktivitásának az allopurinol aktivitásával való összehasonlítása céljából olyan kísérleteket is végeztünk, amelyek során az inhibitor koncentrációját körülbelül 10"4 és 10" 8 között változtattuk és mértük a xantin-oxidáció kezdeti sebességét. Az inhibitor --koncentráció logaritmusának a gátlási százalékkal való egybevetése alapján számítottuk ki az 50%-os gátlást biztosító inhibitor-koncentrációt (Iso -érték). Ezt az értéket az említett módon felvett grafikonon kapott egyenes vonalak lineáris regressziós analízise útján kapjuk. 7
