167432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgoteinben dús fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből

167432 3 4 módszer szerint az oldható fehérjéket pufferoldat ban oldják, az oldatból megfelelő oldószerrel (például acetonnal) és/vagy valamely sóval (például ammóniumszulfáttal) elválasztják a kismolekulasúlyú anyagokat, (e kezelés hatására az orgotein az egyéb oldható fehérjékkel együtt kicsapódik, és a kismolekulasúlyú anyagok a felülúszóban maradnak), ezután a hőre labilis fehérjéket néhány percig 50—65 C°-on végzett hőkezeléssel kicsapják, majd a felülúszóban található fehérjéktől gél-elektroforézissel vagy molekulaszitaként ható gyantaoszlopon végzett kromatografálással elválasztják az orgoteint. A 3 687 927 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás az előző módszer tökéletesített változatát ismerteti. Az eljárás szerint néhány műveleti lépést elhagynak, és lényegesen növelik a hozamot. A 3 579 495 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet orgotein elkülönítésére vörös vérsejtekből, amelynek során a homoglobint oldószeres előtisztítással és hőkezeléssel távolítják el. Az eljárás teljes hozama koncentrált vörös vérsejtekre számítva 0,01%. A fent ismertetett eljárások némelyikében DEAE-cellulóz kromatográfiás tisztítást használnak a vörös vérsejtekből történő orgotein izolálására. Legegyszerűbb az az eljárás, amely szerint a vörös vérsejtekből a hemoglobint oldószeres kicsapásisal távolítják el, majd ezt K2HPO4 — avetonos frakcionálás követi. Hemolizált marha vörös vérsejtek frakcionált oldható fehérjéinek egy részét pH 7,4-nél kromatografálták, így 3 liter koncentrált sejtből 190 mg orgoteint kaptak^ amelynek szuperoxiddiszmutáz aktivitása 3,300 egység/mg volt. (0,00,6%-os teljes termelés, 60'%-os orgotein kinyerés.) (3 687 927 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás.) Ez az eljárás, bár laboratóriumi méretekben elfogadható, a gazdaságosság terén nem versenyképes azokkal az eljárásokkal, amelyeket később dolgoztak ki. Például, ha az eljárás méreteit változtatás nélkül nagyítjuk, egy kilogramm orgotein előállításához több mint 7500 liter kloroform, 4500 liter etanol, 7000 kg K2HPO4 és 5000 liter aceton lenne szükséges. A 3 763 137 sz.. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás oldószermentes eljárást ismertet, amelyben ioncserélő kromatográfiával, közvetlenül a hemolizált vörös vér sejtekből, lényegében tiszta orgotein nyerhető. Ez az eljárás ugyan mentes azoktól a nehézségektől, amelyeket a keverék oldószer és az ammóniumszulfát kicsapószer használata okoz, de hátrányos anynyiban, hogy nagy térfogatú folyadék kromatografálását teszi szükségessé, tehát megfelelően nagy méretű kromatografáló oszlopokat kell használni. Hátrányos továbbá, hogy a kromatografálandó fehérjéknek több mint 99,8%-a idegen fehérje, ami az oszlop élettartamát és a kromatografálás sebességét korlátozza. Az eljáráshoz szükséges a teljes hemolizátum dialízise azért, hogy az ionerősséget megfelelően alacsony szintre lehessen csökkenteni. A dializált lizátum nem stabil és a kiváló fehérjék eltömik az ioncserélő oszlopot, amennyiben nem tisztítják a lizátumot az oszlopra töltés közben. Az oszlopon az átfolyási sebesség visszonylag kicsi, és a nagy mennyiségű fehérjeszerű szennyezés adszorpciója az oszlop adszorpciós kapacitását csökkenti. Néhány orgotein fajta (például lóorgotem) adszorpció-eluciójának sebessége pedig igen kicsi. Röviden: bár a fenti szabadalmi leírás szerinti eljárás a korábbiakkal szemben jelentős előrehaladást jelent az orgotein izolálására, hátrányai is vannak. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a 3 763 137 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerinti eljárás hátrányai kiküszöbölhetők, miközben az eljárás egyszerűsége és gazdaságos kivitelezhetősége megmarad — a vörös vérsejtek előkezelésével, amellyel orgoteint tartalmazó, de lényegében hemoglobin és szénsav anhidráz mentes oldatot állítunk elő. Egy ilyen oldatot sokkal kisebb oszlopon kromatografálhatjuk, mint amilyen a lizált vörös vérsejtek alkalmazása esetén szükséges. Ez különösen akkor igaz, ha a kiindulási oldatot kromatografálás előtt betöményítjük, amit nem lehet könnyen megtenni lizált vörös vérsejtekkel. A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy annak a fehérje mennyiségnek, amelyet a 3 763 137 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerinti eljárásban a kromatografáló oszlopon keresztül kell vinni, kevesebb mint egy százaléka kerül kromatografálásra, és ugyanazt a mennyiségű orgoteint izoláljuk; az alkalmazott kromatografáló gyantaoszlop élettartama így hosszabb, az átfolyási sebesség nagyobb, és a gyanta szelektivitása jobb, tehát kevésbé pontosan szabályozott elució szükséges. A találmány szerinti eljárás nyilvánvaló előnye a 3 579 495 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással szemben az, hogy a hemoglobint és a szénsavanhidrázt, amelyek a vörös vérsejtek fehérjéinek körülbelül 99'%-át alkotják, egyidejűleg távolítjuk el, szerves oldószer használata nélkül. A találmány szerint tehát ipari méretekben is egyszerűen és könnyen végrehajtható eljárást biztosítunk hemoglobin- és szénsav-anhidrázmentes orgotein koncentrátum előállítására. Az így kapott, orgoteinben dús fehérje-koncentrátumból ipari méretekben igen gazdaságosan állítható elő tiszta orgotein. A találmány tárgya tehát eljárás orgoteinben dús, lényegében hemoglobin- és szénsav-anhidráz-mentes fehérje koncentrátum előállítására vörös vérsejtekből, vagy vörös vérsejt-forrásból, amelynek során a hemoglobint, az orgoteint, a szénsav-anhidrázt és a vörös vérsejtek egyéb oldható fehérje-anyagait tartalmazó elegyből hőkezeléssel kicsapjuk a hemoglobint, a szénsav-anhidrázt és az egyéb hőre labilis fehérjéket, és elegyet lehűtjük, a kicsapott fehérjéket elválasztjuk, és a felülúszóból elkülönítjük az orgoteint. A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a hemoglobint, a szénsav-anhidrázt és az egyéb hőre labilis fehérjéket egyidejűleg választjuk le úgy, hogy a vörös vérsejteket — vagy vörös vérsejt forrást — 5 és 8 közötti pH-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2