167411. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldhatatlan fehérje-készítmények előállítására
9 167411 10 b) A mikroorganizmusok szuszpenziója gazdaságosan, célszerűen csupán egyszer használható fel. c) A mikroorganizmusok szuszpenziója olyan szennyezéseket és más enzimeket tartalmaz, amelyek a penicillint és/vagy 6-APS-t a 0-laktámgyűrű felnyitása útján dezaktiválják. d) A szuszpenzió csak kisebb mennyiségben tartalmaz penicillin-acilázt. Nagyobb mennyiségű enzim felhasználása pl. rövidebb reakcióidő és ezzel jobb 6-APS hozam elérése céljából gyakorlati szempontból megoldhatatlan idegen kísérő szennyezések alacsony szinten tartásával. e) A 6-APS-ben kifejezett üzemi hozamok a csökkenő penicillin-aciláz képződéstől függnek a mindenkori fermentációs adagokban. f) A szuszpendált mikroorganizmusok teljes leválasztása a 6-APS-adagok feldolgozásánál pótlólagos munkafolyamatot jelent, amely a hozam csökkenésére vezet. A fehérjeszerű szennyeződések eltávolítására - amelyek allergénreakciókat okozhatnak - további tisztítási műveletek beiktatása szükséges (v.o. 1169 696, 1078 847 és 1 114 311 számú brit szabadalmi leírások). Az összes felsorolt hátrány elkerülhető, ha a mikroorganizmusok szuszpenziója helyett olyan penicillin-acilázt alkalmazunk, amely kovalens kötéssel egy vízoldhatatlan hordozóanyaghoz van rögzítve. 6-APS előállítására irányuló kísérletek penicillinek enzimatikus hasítása útján hordozókhoz rögzített penicillin-aciláz segítségével ugyan ismeretessé váltak (v.o. 1917 057 és 1 907 365 számú NSzK közrebocsátási iratok), de ezeket az eljárásokat ipari méretbe nem sikerült átvinni. Ennek oka egyrészt a felhasznált hordozóanyagok mechanikai tulajdonságaival függ össze, amely nem elég kopásálló, másrészt mérsékelt eljárási kihozatalok mellett csak gyenge specifikus aktivitás érhető el a hordozókhoz kapcsolt penicillin-acilázok segítségével. A 2 157 970 számú NSzK közzétételi iratból ismert oldhatatlan enzim alkalmazása, amelyben a penicillin-aciláz kovalens kötéssel akrilamidból, N.N'-metilén-bisz-akrilamidból és maleinsavanhidridből nyert keverékpolimerhez van rögzítve a penicillin ipari méretű bontásánál hátrányos, mivel az oldhatatlan enzim erős mértékben duzzad és mechanikai szempontból nem ellenálló. Ezek a hátrányok az előállított gyanták ismételt felhasználását ipari méretben befolyásolják. Azt találtuk, hogy a felsorolt hátrányok elkerülhetők, ha a találmány szerinti vízoldhatatlan hordozóanyaghoz rögzített penicillin-acilázt alkalmazunk a penicillinek hasítására. A penicillinek hasítása a találmány szerinti hordozóanyaghoz kötött penicillin-aciláz segítségével egyszerűen és nagyüzemi méretben is kivitelezhető. A hordozóhoz kötött oldhatatlan enzimet 75 000- 150 000 NE/ml tartalmazó penicillint, pl. G-penicillint vagy V-penicillint tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. Az enzimatikus hasítást állandó pH értéken 6- és 9 között, előnyösen a mindenkori rögzített penicillin-aciláz pH-optimumának tartományában pl. 7,8 pH-értéken 5 végezzük. A lehasított acilgyök pl. a fenilecetsav vagy a fenoxiecetsav semlegesítésére vizes alkáli-oldatokat pl. káliumhidroxidot vagy nátriumhidroxidot vagy szerves aminokat, előnyösen trietilamint alkalmazunk. A lúg felhasználásából meg-10 állapítható a hasítás reakciósebessége és befejeződése. A penicillin-aciláz katalizátor hatást fejt ki mind a penicillin elbontására 6-APS-sé, mind a penicillin újbóli szintézisére a bomlás-termékekből. Az egyensúly a közeg pH-értékétől függ. 15 Alacsonyabb pH-értéken az egyensúly a kiindulási anyagként használt penicillin kiindulóanyag javára tolódik el. Ez a jelenség hasznosítható penicillinek átacilezésére más acilgyökök jelen-20 létében vagy penicillinek szintézisére 6-APS-ből kiindulva. Az enzimatikus hasítás reakcióhőmérséklete előnyösen 38 C°. Alacsonyabb hőmérsékleten az enzim aktivitása csökken. A hasítást pl. 25 C°-on 25 végezve kétszerakkora mennyiségű enzimet kell alkalmazni, mint 38 C°-on, feltéve, ha azonos reakcióidő leforgása alatt kívánjuk a reakciót befejezni. 30 A reakciósebesség az adott hőmérsékleten a hordozóhoz kötött penicillin-aciláz specifikus aktivitásától és mennyiségétől függ. Ezenkívül a reakciósebesség függ a hordozóanyaghoz rögzített penicillin-aciláz mennyiségének arányától a peni-35 cillin koncentrációjához képest. A hasításhoz alkalmazott reakcióelegy, amelynek koncentrációja 100 000 NE/ml (1 mg G-kálium-penicillin megfelel 1598 NE nemzetközi egységnek) 10 óra leforgása alatt 7,8 pH értéken és 38 C°-on teljesen hidroli-40 zálódik 6-APS-sé és fenilecetsavvá, ha 1 egység penicillin-acilázra számítva 3 • 10 s egység G-penicillint alkalmazunk, (1 enzimegység (E) úgy határozható meg, mint az az aktivitás, amely egy mikromól 6-nitro-3-(fenilacetil)-aminobenzoesavat 45 (NIPAB) 1 perc alatt 25 C°-on hidrolizálni képes). A száraz enzimgyanta mennyisége csupán 0,5-1% a reakciókeverékre számítva. Ha 105 NE G-penicillinre számítva 2 egység penicillin-acilázt alkalmazunk, akkor a teljes mértékű hasítás mindössze 50 2 órát vesz igénybe. Ennél rövidebb reakcióidő is megvalósítható, ha még nagyobb mennyiségű penicillin-acilázt alkalmazunk, továbbá, ha kristályos enzimből készült hordozóhoz rögzített penicillin-acilázt alkalmazunk. 55 A találmány szerinti hordozóhoz rögzített penicillin-aciláz gyöngyformában állítható elő és nagy mechanikai stabilitásával és viszonylagos nagy fajsúlyával tűnik ki. Ezek a tulajdonságok többféle 60 felhasználás esetén is hosszabb ideig történő alkalmazást tesznek lehetővé. Az említett tulajdonságok szakaszos eljárásoknál intenzív keverést és centrifugával veszteség nélküli egyszerű elválasztást tesznek lehetővé anélkül, hogy mechanikai igénybe-S5 vétel, pl. kopás folytán veszteség lépne fel. Ezáltal 5
