167369. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lazac kalcitonin és származékai savaddiciós sóinak előállítására
f 167369 8 B részsorozat:BOC-Aig-Thr-Asn-Thr-€iy-NHNH2 a) Z-Asn-Thr-Gly-OEt 43 g Z-Thr-Gly-OEt-t feloldunk 500 ml di- 5 metilformamidban és szobahőmérsékleten atmoszférikus nyomáson palládiumszén jelenlétében hidro génezzük. Szűrés után a szűredékhez 60 g Z—Asn—OCP-t adunk, 16 óra hosszat 25°-on állni hagyjuk, kb. 250 ml-re koncentráljuk, etilacetátot 10 adunk hozzá, híg sósavval mossuk, nátriuínszulfáton megszárítjuk, és szárazra bepároljuk. A maradékot etilacetáttal mossuk, és megszárítjuk. Z-Asn-Thr-Gly-OEt-t kapunk. Olvadáspontja 225°, [a]f>° = -4° (c=l, dimetilformamidban). 15 b) Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt 29 g Z-Asn-Thr-Gly-OEt-t feloldunk 700 ml dimetilformamidban, atmoszférikus nyomáson és 20 szobahőmérsékleten palládiumszén jelenlétében hidrogénezzük, leszűrjük, a szűredékhez hozzáadunk 30 g Z-Thr-NHNH2 -ből készült Z-The-N 3 -at (lásd az A a) részsorozatot). 0°-on való 12 órai állás után szárazra bepároljuk, a maradékot vízzel, éterrel 25 és etanollal mossuk. Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt-t kapunk. Olvadáspontja 230°, [aß 0 = -8° (c= 1, dimetilformamidban. c) BOC-Arg(N02 )-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH 2 22 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt-t feloldunk 700 ml dimetilformamidban és atmoszférikus nyo- 35 máson és szobahőmérsékleten palládiumszén jelenlétében hidrogénezzük, és leszűrjük. 23 g BOC-Arg(N02 )-OH-t feloldunk 500 ml dimetilacetamidban, hozzáadunk 12 ml trietilamint, -10°-ra hűtjük, hozzáadunk 9,4 ml klórhangyasav- 40 -izobutilésztert, 10 percig reagáltatjuk, és hozzáadjuk a fent készült tetrapeptid oldatot. 25°-on való 30 perces állás után hozzáadunk 100 ml vizet, a kapott oldatot hidroxilfázisban levő Amberlite-IRA-410-zel kezeljük negatív klórreakcióig, meg- 45 szűrjük, és szárazra pároljuk. A maradékot kloroformmal, etilacetáttal és éterrel mossuk, és megszárítjuk. BOC-Arg(N02 )-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt-t kapunk. Olvadáspontja kb. 100°, [aß0 =-4° (c=l, dimetilformamidban). 50 12 g BOC-Arg(N02 )-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt-t feloldunk 200 ml ecetsav és 40 ml víz elegyében, palládiumszén jelenlétében 20°-on atmoszférikus nyomáson hidrogénezzük, leszűrjük, és vákuumban 20°-on szárazra pároljuk. A maradékot dimetil- 55 formamidban oldjuk, és bepároljuk. Ezt a kezelést addig ismételjük, míg már nem mutatható ki ecetsav. A maradékot 120 ml dimetilformamidban oldjuk, hozzáadunk 6 ml hidrazinhidrátot, 16 óra hosszat 25°-on állni hagyjuk, bepároljuk, a mára- 60 dékot éterrel és. 1 :1 arányú metanol-éter eleggyel, majd ismét éterrel mossuk, és megszárítjuk. BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2-kapunk. Olvadáspontja 175° (bomlik), [aß 0 ] =42° (c = l, 1 :1 arányú dimetilformamid-sósav elegyben. 65 AB részsorozat: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 2CH 3 COOH 13,5 g BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHj (B részsorozat) feloldunk 270 ml 8:2 arányú dimetilformamid-víz elegyben, —15°-ra hűtjük, hozzáadunk 40 ml 4 n dioxános hidrogénklorid-oldatot és 2,5 ml terc-butilnitritet. Tíz percig — 15°s>n keverjük, hozzáadunk 28 ml trietilamint, leszűrjük, hozzáadunk 10,5 g H-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 -t (A részsorozat), 16 óra hosszat 0°-on keverjük, majd szárazra pároljuk, a maradékot éterrel mossuk, és megszárítjuk. A maradékot metanolban oldjuk, 1 :10 térfogat vizet és hétszeres mennyiségű kloroformot adunk hozzá, és az oldatot átbocsátjuk egy 500 g kovasavgélt tartalmazó oszlopon. Növekvő mennyiségű metanollal való eluálás után bepárolva BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 -t kapunk. Ezt 200 ml 4n dioxános hidrogénklorid oldatban szuszpendáljuk, és 2 óra hosszat "25°-on keverjük. A szuszpenziót szárazra pároljuk, a maradékot 0,2 n ecetsavban oldjuk, acetátfázisú Amberlite—IRA—410 ioncserélő műgyantával kezeljük, és a vizes oldatot liofilizáljuk. Ezután a maradékot éterrel, etilacetáttal és ismét éterrel mossuk, és nátriumhidroxid forgácson megszárítjuk. H—Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser— Gly-Thr-Pro-NH2 • 2CH 3 COOH-t kapunk. Olvadáspontja 195° (bomlik), [aß 0 =-64° (c=l, 1 :1 arányú dimetilformamid-n-sósav elegyben). C részsorozat: Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH a) H-Thr-Tyr-Pro-OH 176 g Z-Tyr(Z)-Pro-OMe-t feloldunk 1000 ml metanol-n sósav elegyben, palládiumszén jelenlétében 20°-on és atmoszférikus nyomáson hidrogénezzük, és bepároljuk. A maradékot 400 ml dimetilformamidban oldjuk, 0°-on hozzáadunk 100 ml trietilamint, a kikristályosodott trietilaminhidrokloridot szűréssel eltávolítjuk, és a szüredékhez Z-Thr-N3 -at adunk (készül 87 g Z-Thr—NHNH2 -ből az A a) részsorozatot). Ezután 16 óra hosszat 0°-on állni hagyjuk, majd szárazra pároljuk, a maradékot etilacetátban oldjuk, egymás után híg sósavval és lúg ammóniaoldattal mossuk, megszárítjuk, és bepároljuk. A maradékot heptánnal eldörzsöljük, petroléterrel mossuk, és megszárítjuk. Z-Thr-Tyr-Pro-OMe-t kapunk. Olvadáspontja 80° (bomlik), [aß 0 = -23° (c=l, dimetilformamidban). 53 g Z-Thr-Tyr-Pro-OMe-t 530 ml metanolban oldunk, hozzáadunk 100 ml 2n nátronlúgot, 1 óra hosszat 25°-on állni hagyjuk, hozzáadunk 50 ml 2 n sósavat, kb. 200 ml-re koncentráljuk, hozzáadunk 100 ml vizet, beállítjuk 10pH-ra, a vizes oldatot kétszer etilacetáttal mossuk, 4n sósavval beállítjuk 1 pH-ra, a kivált Z-Thr—Tyr-Pro-OH tripeptidet etilacetáttal extraháljuk, megszárítjuk, és bepároljuk. Olvadáspontja 80 , [aß0 = -23° (c=l, dimetilformamidban). 4
