167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
17 167360 18 és káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. 1,05 g (80%) helyettesített oktadekapeptidamid-trifluoracetátot kapunk. A nyers trifluoracetátot 20 ml vízben oldjuk, a trifluoracetát ionokat acetát ciklusú Dowex 1x8 ioncserélő gyantával (Röhm and Haas cég) acetát ionokra cseréljük. Az így kapott oldatot karboximetilcellulóz (Whatman CM-52) ioncserélőből készített 4,5 x 63 cm-es oszlopra öntjük, majd 2 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,5 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferból készített lineáris puffergradienssel 80 ml/óra sebbességgel eluáljuk. A terméket tartalmazó 103—112. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,42 g (37%) aminooxikarbonsawai helyettesített oktadekapeptidamidot kapunk, peptid-tartalom: 82% (UV elnyelés alapján), Met-szulfoxid tartalom: 1,8%, Tyr/Trp arány: 1,07, aminosavanalízis: Lys 3,4 (4), His 1,0 (1), Arg 0,9 (1), Ser 0,8 (1), Glu 0,9 (1), Pro 1,0 (1), Gly 2,05 (2), Val 0,9 (1), Met 0,75 (1), Tyr 0,9 (1), Phe 1,0 (1), R? =0,18. A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawai helyettesített oktadekapeptidamidot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: D-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxikarbonil-amino-kapronsav-diciklohexilamin só [BOC-D-OLys(Z)-OH DCHA] N-e-benziloxikarbonü-L-lizinből állítjuk elő az 1. példa 1. lépésében leírt eljárás szerint. A kapott olajos D-«-terc-butiloxikarbonií-aminooxi-e-benziloxikarbonil-amino-kapronsavat éterben oldjuk és diciklohexilaminnal sóvá alakítjuk. Op.: 159-162 C° (etanol-vízből átkristályosítva), R| =0,15, [<*]D =+35,4° (c = 1, etanol). 2. lépés: D-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxikarbonil-amino-kapronsavamid [BOC-D-OLys(Z)-NH2 ] Da-t erc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxikarbonil-amino-kapronsav-diciklohexilaminsóból állítjuk elő a 3. példa 2. lépésében leírt eljárás szerint. R*=0,42, op.: 95-97 C°, [ajD = 4-28,9° (c = l, metanol). 3. lépés: D-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-amino-kapronsavamid-oxalát (BOC-D-OLys-NH2 oxalát) D-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxikarbonfl-amino-kapronsavamidból állítjuk elő a 3. példa 3. lépésében leírt eljárás szerint. Op.: 155-157 C°, R? =0,30, [a]D = +39,0° (c= 1, metanol). 4. lépés: D-a-aminooxi-e-terc-butiloxikarbonil-amino-kapronsavamid 5 [H-D-OLys(BOC)-NH2 ] D-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-amino-kapronsavamid oxalátból állítjuk elő a 3. példa 4. lépésében leírt eljárás szerint. Op.: 118-120 C°, 10 R? = 0,28, [a]D = +40,4° (c = 1, metanol). 5. lépés: Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC>Lys(BOC)-15 -D-OLys(BOC)-NH2 8," g (9,0 mmol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Ly<BOC)-N2 H 3 -ból és 3,0 g (11,5 mmól) H-D-OLys(BOC)-NH2 -ból állítjuk elő a 3. példa 20 6. lépésében leírt eljárás szerint. Az etilacetátos oldat bepárlása után visszamaradó nyers terméket 20 ml etilacetáí : (piridin : ecetsav :víz = = 20:6:11) = 99:1 arányú elegyében oldjuk és az oldatot 3,2 x 50 cm-es szilikagél oszlopon a fenti 2.S eleggyel kromatografáljuk. Az elutumot 15 ml-es frakciókban szedjük, összetételüket vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A tiszta terméket tartalmazó 85—192. frakciókat összegyűjtjük és az oldószert íedesztilláljuk. 3,70 g (34,5%) védett, 30 aminooxikarbonsawai helyettesített tetrapeptidamidot kapunk. Op.: 132-136 C°, Rf1 =0,23. 6. lépés: 35 H-Ly<BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(BOC)-NH2 HCl 2,0 g (2,10 mmól) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(BOC>NH2 -t 20 ml 80%-os ecet-40 savban oldunk. Az oldatot 20 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Az így kapott aminooxikarbonsawai helyettesített tetrapeptidamid-acetátot (l,68g, op.: 94-95 C°) 17 ml meta-45 nolban oldjuk, majd 1,35 ml piridin és 1,35 ml tömény sósav elegyítésével nyert piridinhidroklorid-oldatot adunk'hozzá és a metanolt ledesztilláljuk. A maradékot 50 ml vízzel eldörzsöljük. Szűrés, vizes mosás, szárítás után 1,2 g (72%) 50 H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>D-OLys(BOC)-NH2 HCl-ot kapunk, op.: 122-125 C°, Rf =0,70. 7. lépés: 55 BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluíOBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC>Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>D-OLys(BOC)-NH2 60 0,995 g (0,5 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC>Pro-Val. -Gly-OHHO-ot, 0,491 g (0,5 mmól) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>D-OLys(BOC>NH2 HQ-ot és 0,800 g (3,0 mmól) PCPOH-t feloldunk 5,0 ml 65 dimetilformamidban és hozzáadunk 0,055 ml 9
