167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
3 167360 4 helyettesítjük. Különösen nagy aktivitású származékhoz jutunk, ha az 1—18-as fragmensben az N-terminális szerin helyett D-a-aminooxi-0-hidroxi-propionsavat, a C-terminális arginin helyett L-vagy D-a-aminooxi-e-amino-kapronsavat építünk be a molekulába. A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű új, ACTH-hatású polipeptidek H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)n-X (I) - ebben a képletben n értéke 3 vagy 4 és X -OLys-OH, -D-OLys-OH vagy -OGly-OH csoportot jelent -, valamint savaddíciós sóik, amidjuk és benzilészterük előállítására. Adrenokortikotrop hatásuk szempontjából megemlítjük a D-OSer1 , Lys 17 , OLys1 • -a 1 " 1 8 -ACTH-OLys 18 -NH 2 -t, D-OSer 1 , Lys17 , -D-OLys 18 -a 1 -1 8-ACTH-D-OLys» 8 -NH 2 -t, és elsősorban hatásosnak bizonyult a D-OSer1 , Lys17 , Lys18 , OGb/'-c^-^-ACTH-OGly^-NHj-A vegyületek farmakológiai hatását Sayers-teszttel [M. A. Sayers, G. Sayers és L. A. Woodbury, Endocrinology 42, 329 (1948), G.Hamburger, Acta Endrocrin. 35, 594 (I960)] határoztuk meg a következő módon: Az adrenokortikotropin aktivitását a mellékvesekéreg C-vitamin szint csökkentő hatása alapján határoztuk meg hipofízis blokkolt Wistar patkányokon, összehasonlításul a 100 E/mg ACTH aktivitású ACTHi-24-et használtuk. A kísérleti állatokat egy hetes kondicionálás után két csoportra osztottuk, egy csoportban 8 patkány volt. Három csoport az összehasonlító vegyületet, három csoport a vizsgálandó pepiidet kapta, egy csoport kontrollként szolgált. Az alkalmazott adag 33, 100 és 300mE/100g volt szubkután beadva. A beadás után két óra múlva az álatokat megöltük és a zsírszövettől megtisztított mellékvesékben mg%-ban meghatároztuk az aszkorbinsav-tartalmat. Az egyes csoportokban kapott értékeket átlagoltuk, és ebből számítottuk ki a relatív hatáserősséget. Az eredményekből kitűnt, hogy a D-OSer1 , Lys17 , Lys18 , OGly^-ai-^-ACTH-OGly^-NHj adrenokortikotrop aktivitása 100 E/mg, vagyis a kisebb tagszám ellenére azonos az összehasonlításul használt ACTHi-24 aktivitásával. A találmány értelmében az (I) általános képletű ACTH-hatású új peptideket, valamint savaddíciós sóikat, amidjukat és benzilészterüket úgy állítjuk elő, hogy az I általános képletnek megfelelő, de legalább a terminális aminooxicsoportján, valamint az oldallánc aminocsoportjain és adott esetben a terminális és az oldallánc karboxilcsoportjain védett pepiidről - X és n a fenti jelentésű — a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet savaddíciós sójává, amidjává vagy benzilészterévé átalakítjuk. A kiindulási anyagként használt védett peptideket a megfelelő a-aminooxisavakból és aminosavakból kiindulva önmagában ismert módon, fragmenskondenzációval vagy aminosavkénti lánchosszabbítással állítjuk elő, amikor a vegyesanhidrides, azidos, aktívészteres és DCC-s technikát használhatjuk, de alkalmazhatjuk az úgynevezett 5 szilárdfázisú szintézist is, amelynél a láncvégi karboxilcsoportjával valamely polimerrel összekapcsolt peptidet úgy építünk fel, hogy az aminosavakat, végül pedig az a-aminooxikarbonsavat a polimerhez kötött C-terminális a-aminooxisavhoz 10 megfelelő sorrendben hozzákapcsoljuk. A reakciókban részt nem vevő funkciós csoportokat célszerűen védjük a peptidszintézisnél szokásos védőcsoportokkal, különösen hidrolízis, acidolízis, hidrazinolízis vagy redukció útján könnyen 15 lehasítható csoportokkal. A karboxilcsoportot előnyösen például metanollal, terc-butanollal, benzilalkohollal, p-klórbenzilalkohollal, p-nitrobenzilalkohollal észterezve vagy amidképzéssel védhetjük, az aminooxi- és aminocsoportok védelmére pedig első-20 sorban a tozil-, tritil-, formil-, trifluoracetil-, o-nitro-szulfenil-, ftalil-, benziloxikarbonil-, p-klórbenzil-oxikarbonil-, különösen a terc-butiloxikarbon'1 csoportot használjuk. Az arginin guanidino-csoportjának védésére mindenekelőtt a nitrocsoport alkal-25 mas, de protonált formájában is tudjuk alkalmazni. A hisztidin iminocsoportja benzil-, tritil-, vagy dinitrofenil-csoporttal védhető. Az oldalláncok hidroxilcsoportjait esetenként éter formájában védjük, amikor előnyösen alkalmazhatók a terc-butanollal 30 és a benzilalkohollal képzett éterek. A' védőcsoportok megfelelő kombinációjával el tudjuk érni, hogy ezek önmagukban ismert módszerek szerint például hidrolízissel, acidolízissel hidrazinolízissel vagy redukcióval külön-külön, il-35 letve egyszerre eltávolíthatók legyenek. A kiindulási vegyületek előállításának egyik előnyös kiviteli módja értelmében úgy járhatunk el, hogy egy védett a-aminooxikarbonsavat H-Tyr-Ser-40 -Met-OCH3 tripeptid metilésztenel kondenzálunk és a helyettesített tetrapeptid metilészterből képzett hidrazidot aziddá alakítva acilezzük a H-Glu(OBut)-His-Phe-Arg-Tri)-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH dekapeptidet és az így kapott helyette-45 sített tetradekapeptidet a megfelelően védett teljes további aminosav szekvenciából álló peptid észterrel kondenzáljuk, majd az így kapott helyettesített peptidészterből képzett hidrazidot aziddá alakítva megacilezzük a megfelelően védett C-terminális 50 aminooxisav származékot. Például helyettesített oktadekapeptid előállítása esetén a 15—17-es tripeptid észterrel, helyettesített nonadekapeptid előállítása esetén a 15—18. tetrapeptid észterrel kondenzáljuk. Ilyen kondenzációnál kapcsolási módszerként elő-55 nyösen használható a DCC-s vagy az aktívészteres módszer. Az utóbbi esetben, különösen pentaklórfenil- vagy pentafluorfenil-észter alkalmazásánál az aktív észtert nem szükséges elkülönítenünk, hanem a kondenzációs reakcióelegyben képezhetjük a 60 helyettesített tetradekapeptidből pentaklórfenol vagy pentafluorfenol és DCC segítségével [155 880 számú magyar szabadalmi leírás, és Kisfaludy és munkatársai, Chemistry and Biology of Peptides, Ann Arbor Science Publ., New York 65 1972, 299. oldal]. 2
