167327. lajstromszámú szabadalom • Eljárás libainfluenza elleni hiperimmun szérum előállítására
167327 . 3 4 időben a virus hatására elhalt embriókat és a tojások membránját homogenizáljuk, hozzáadjuk az allantoamnion folyadékot, majd fiziológiás konyhasó-oldattal végzett hígítás után a hígított antigén folyékony fázisával libákat két alkalommal oltunk, a 2. oltást követő 8-14 napon, előnyösen 10-12. napon az állatokat elvéreztetjük, majd a vérsavót elválasztjuk, a szérum ártalmatlanságának biztosítására valamely ismert virucid és baktericid anyaggal, előnyösen j3-propiolaktonnal kezeljük és ismert módon konzerváljuk. Előnyösen úgy járunk el, hogy a kapott antigénnel 33-35 napos ún. pecsenyelibákat vagy nem hizlalt felnőtt libákat oltunk két izben, 10—12 napos időközben, mimellett az első oltás adagja 2 ml és a másodiké 15 ml. Az állatok elvéreztetése után kapott, elválasztott vérsavót előnyösen 2°/oo 0-propiolaktonnal kezeljük, majd körülbelül két hét múlva 0,5% fenollal konzerváljuk. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példával szemléltetjük: Példa A virusantigén termeléséhez az ún. libainfluenzától mentes állományból 9 napig előkeltetett és megfelelően fejlett embriót tartalmazó libatojásokra van szükség. A libatojásokat állategészségügyileg rendszeresen ellenőrzött tojóállományból szerveztük be. A \lrusantigén előállítását a következőképpen végezzük. A tojások lámpázása során megjelöljük az embrió helyeződését és a légkamra határát. A tojásokat ezután alkohol-jód oldattal fertőtlenítjük, majd tompa végükkel felfelé tojástartó állványra helyezzük. Az oltás részére a légkamra határától 2-3 mm-re felfelé nyílást készítünk és ezen keresztül az embrió fekvése irányában az allantoisüregbe juttatunk 0,2 ml hígított vírusszuszpenziót. A hígított vírusszuszpenzió a sterilitásra és vírustartalomra ismételten ellenőrzött és —20 C°-on tárolt libainfluenza ,,B" törzsvírus élettani konyhasóoldattal készített 1 :10 arányú hígítása, amely ml-ként 2 000 E penicillint és 10 mg streptomicint tartalmaz. A tojások fertőzésére használt hígított vírusszuszpenzió sterilitási vizsgálatát a következőképpen végezzük el. 37 C°-on termosztátban történő tenyésztéshez a vírusszuszpenzió 0,5—0,5 ml-ével oltunk be egy-egy cső agart, lóhuslevest és Tarozzi-f. táptalajt, a szobahőmérsékleten (22 Cc ) történő vizsgálathoz ugyancsak 0,5-0,5 ml-t oltunk egy-egy cső maltózt tartalmazó agárra, lóhuslevesbe és Tarozzi-f. táptalajba. A 37 C°-on tartott táptalajokat egy hét után, a szobahőmérsékleten tartottakat pedig 14 nap után bíráljuk el. Embrió oltásra csak az a vírus használható, amely a fenti vizsgálat alapján csiramentesnek bizonyult. A vírustartalom vizsgálata az alábbiak szerint történik. A vírusszuszpenzióból élettani konyhasóoldattal 10-es léptékű hígítási sort készítünk, majd a hígításokból 0,2-0,2 ml-t fecskendezünk 5-5 db 10 napos előkeltetett libatojás allantoisüregébe. A továbbra is 37 C°-on tartott tojásokat a 7. napig, naponta kétszer lámpázzuk és az elhalt embriókat 5 tartalmazó tojásokat felbontjuk. Vírus jelenlétére utal az, ha a 4. naptól kezdve elhalt embriókban a chorioallantois membrán ödémás, az embrió erősen kipirult, bőrén testszerte elszórtan tűszúrásnyi-gombostűfejnyi vérzések láthatók, a bőr 10 alatti kötőszövet vizenyős, a szívizom halvány, a szív kitágult, a májon vérzések és halványsára, elfajulásra utaló foltok találhatók. A pozitívnak tálát embriók száma alapján Reed- és Muench módszerével meghatározzuk a vírustitert. (Reed, L. 15 J., Muench, H.: A simple method of estimating fifty percent end point. Amer. Hyg. 1938. 27 493-497) Embrió oltásra a 104' 0 ELD 50 /0,2 ml literű virus használható. Oltás után a tojáshéjon ejtett nyílást olvasztott 2o parafinnal zárjuk le, majd a tojásokat 37 C° hőmérsékletű keltetőbe helyezzük. A beoltott tojásokat az első három napon naponta egyszer, a 4-7. napok között naponta kétszer lámpázzuk. Az első 3 nap alatt elhalt 25 embriókat kiselejtezzük, a 4. naptól az elhalt embriókat tartalmazó tojásokat +4C° hőmérsékletű hűtőben gyűjtjük és a vírust naponta aratjuk a következő módon. A tojások tompa végét alkoholos jód oldattal 30 fertőtlenítjük, majd a mészhéjat a légkamrának megfelelően ollóval eltávolítjuk. A héjhártyát és a chorioallantoishártyát csipesszel felszakítjuk, majd az allanto-amnion folyadékot leszívjuk. Ezután a tojásból az embriót és a megvastagodott chorioal-35 lantois-membránt kiszedjük. A membránt és az embriót turmix segítségével feltárjuk és a zúzalékot 1 :1 -1 : 1,5 arányban élettani konyhasó oldattal hígítjuk. Az embrió és a membrán hígított szuszpenzióját az összegyűjtött allanto-amnion 40 folyadékkal keverjük, majd centrifugáljuk. Az így elkészített antigénhez ml-ként 400 E penicillint, 4 mg streptomicint és 0,3 mg chloromicetint adunk és felhasználásig -20 C°-n tároljuk. A hiperimmunizálásra kerülő antigént felhasz-45 nálás előtt vírustartalomra és ártalmatlanságra ellenőrizzük. A vírustartalom vizsgálata az előzőekben leírt módon történik. Hiperimmunizálásra akkor használható fel az antigén, ha titere legalább 10-4 .°ELD S0 /0,2ml. 50 Az antigén ártalmatlanságának ellenőrzésére 10 darab 28-35 napos, jól fejlett növendéklibát oltunk a nyak bőre alá az antigén 30 ml-es adagjával. Egyidejűleg 10 növendék libát oltatlanul hagyunk. A 15 napos megfigyelési idő alatt az 55 antigénnel oltott libáknak tünetmentesnek kell maradniok, illetőleg az esetleg más okból adódó megbetegedés vagy elhullás aránya nem haladhatja meg az oldatlan kontrollok között adódó hasonló kieséseket.. 60 A hiperimmun szérum előállításához 33—35 napos ún. pecsenyeliba, vagy nem hizlalt felnőtt liba használható. A hiperimmunizálásra kerülő pecsenyelibák lehetőleg ne részesüljenek 3—4 napos korban az ún. libainfluenza elleni szérumos 65 védőoltásban, mert a szervezetben még nyomokban 2
