167316. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-acil-hidrazonometil-rifamicin-SV-származékok előállítására
5 167316 6 polimerázán és tisztított enzimek (poly d A-Tas templát) DNS- függő DNS-polimeráz- aktivitásán vizsgáltuk. A gátló hatást a C. Gurgo és társai [Nature, New Biology, 229, 11, (1971)] által leírt módszerek szerint vizsgáltuk. A különböző gyógyszerkoncentrációknak polimeráz-aktivitásra kifejtett hatását úgy határoztuk meg, hogy H3TTP-nak (tritiummal jelzett timindezoxiribozid-trifoszfát) az oldhatatlan fázisba való beépülését követtük. A kísérleti eljárások egy tipikus példáját a következőkben mutatjuk be: 1. Vírus izolálása és vírusos polimeráz tisztítása Vírust az előzőekben leírt módon [Green és társai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385-393, (1970), Rokutanda és társai, Nature, 227, 1026-1028, (1970)] egér-sarcomavírus (Moloney izolátum) által transzformált patkánysejtekből (78A1 sejtek) és egér-sarcomavírus (Harvey izolátum) által transzformált egérsejtekből (MEH sejtek) izoláltunk és tisztítottunk. A virion-polimerázt 20-40-szeresen tisztítottuk úgy, hogy a tisztított vírust 0,1 mólos NaCl-ban levő 0,5% NP-40 (nonidet P-40), 0,01 mólos Triszpuffer (pH = 7,6) és 0,001 mólos EDTA keverékében szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk és 15-30% szacharóz-gradiensben, 10 mmólos Na-foszfát-puffer (pH = 7,4), 2,5 mmólos MgCl2 > 10 mmólos ditiotreit és 5% glicerin keverékében 24 óráig 38 000-es fordulatszámmal egy Spinco SW41 rotorban zónás centrifugálásnak vetettük alá. A 22 összegyűjtött frakcióból az enzimaktivitás- csúcsfrakcióit (13—17) összegyűjtöttük és —70 C°-on, 30% glicerinben tároltuk. DNS-polimeráz elemzés Az enzim inkubációját a Green és társai által leírt módon [Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385-393, (1970)] 1 óráig, 37 C°-on, 100/ul olyan reakciókeverékben végeztük, amely 40 mmól Trisz-puffert (pH = 8,0), 5 mmól ditiotreitet, 30 mmól NaCl-ot, 2,5 mmól MgCl2-ot, 0,1 mmól dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és lOjuC: 3 H-dTTP-t, (12-18 Ci/mmól) tartalmazott. A reakciót 150/il In perklórsav hozzáadásával fejeztük be. Borjúthymus-DNS-t (100 g) adtunk hozzá hordozóként, a radioaktív DNS terméket az előbb említett két irodalom szerint kezeltük. Az endogén DNS-függő DNS-polimeráz aktivitást 0,01% NP-40-nek a tisztított vírushoz való hozzáadása után a vizsgálat időpontjában mértük. A tisztított vírusos polimeráz DNS-polimeráz-aktivitását 2//g poly d(A-T) tempíáttal, NP-40 nélkül mértük. Rifamicin-származékok gátló hatásának vizsgálata A rifamicin-származékokat 5 mg/ml-es koncentrációban dimetilszulfoxidban (DMSO) oldottuk és 4 C°-on tároltuk. Az endogén RNS-függő DNS-polimeráz-aktivitást úgy vizsgáltuk, hogy DMSO-ban megfelelően oldott 2 jul származékot vagy 2/il DMSO-t (kontroll) adtunk a vizsgálati keverékhez a 15-30 ßg vírusos proteint tartalmazó szétroncsolt vírus hozzáadása előtt. Az enziminkubálást 60 percig 37 C° -on végeztük. A tisztított enzim 5 gátló hatását úgy vizsgáltuk, hogy 2 jul származékot vagy DMSO-t 30 jul enzimmel (1-2 jug protein) 10 percig 37 C°-on előinkubáltuk, ezután 70 ßl szubsztrátum keveréket adtunk hozzá, majd a keveréket tovább inkubáltuk és az előzőekben 10 leírtak szerint kezeltük. Reprezentatív vizsgálatokban a találmány szerinti eljárás vegyületei 2-100 ßglml vagy ennél kisebb koncentrációban a H3-dTTP beépülését 10%-nál kisebb értékre csökkentették, mint amit a 15 kontrollvizsgálatoknál találtunk, világosan bebizonyítva az RNS-tumorvírusok által okozott rákfejlődés mechanizmusára gyakorolt gátló hatást, a legújabb biokémiai szemléletnek megfelelően. A reverz- transzkriptázok gátló hatását egér 20 leukémiavírus- polimerázon végzett vizsgálattal is igazoltuk. Az egér-leukémia-vírus RNS-függő DNS-polimerázát Triton X 100 szétroncsolt virionokból preparáltuk, Gallo és társai leírása szerint [Gallo és társai, Nature, New Biology, 232, 141, (1971)]. 25 Mind a Rauschez, mint a Moloney típusú vírusokat előzetesen tisztítottuk, megkötve azokat szaharóz fajsúlygrádiens 1,16 g/ml-es tartományában, miután előzetesen kis sebességű centrifugálással a sejttörmeléket eltávolítottuk és a felülúszót 60 és 20% 30 közötti szaharóz gradienssel tisztítottuk. A víruspreparáció végső koncentrációja 101 * részecske/ml volt. Templátként endogén 70S RNS-t alkalmaztunk. Az enzim gátlása szempontjából az 50 mg/ml vagy ennél kisebb koncentrációt találtuk hatásos-35 nak. Emberi eredetű tumorsejt-polimerázok használatával hasonló eredményeket kaptunk. Ez esetben a gátló hatást normál sejtpolimerázokon is tanulmányoztuk, hogy a szelektív hatást jellemezzük. AzI képletnek megfelelő reprezentatív rifa-40 micin-származékok hatását két tisztított DNS-polimerázon értékeltük, amelyeket 1. emberi normál (PHA stimulált) vér lymphocitákból, 2. lymphoblast sejttenyészetből (normál donortól származó) és 3. emberi leukémiás vér lymphoblastjaiból izolál-45 tunk. Szintetikus és/vagy természetes templátokat használtunk. A kísérleti eljárás egy jellegzetes példáját az alábbiakban ismertetjük: Emberi vér lymphoblastok 50 Leukémiás lymphoblastokat leukophoresis által előidézett akut lymphocitás leukémiában (ALL) szenvedő betegek perifériás véréből izoláltunk. A sejteket átmostuk és hipotóniás lízissel eltávolí-55 tottuk az erythrocitákat. Normál lymphocitákat egészséges donorok perifériás véréből nyertünk, miután a granulocytákat nylon oszlopkromatográfiával eltávolítottuk. Phytohemagglutininnel (PHA) stimuláltuk őket 72 órán át az előzőekben 60 leírtak szerint [Gallo és társai, Nature, 228, 927, (1970), Gallo és társai, Science, 165, 400, (1968)], hogy a DNS polimeráz aktivitást a maximálisra növeljük. Ezeknek a sejteknek elegendő nagy mennyiség-65 ben való előállítása azonban problémát jelent, ezért 3
