167276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-27106 jelű metabolit előállítására
167276 11 12 A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal szemléltetjük. 1. példa Az A 27106 előállítása monensinből Streptomyces candidusszal Benett-agarból készített ferde-agaron Streptomyces candidus NRRL 5449-et növesztünk, amikor egy jól látható telepet kapunk. Eltávolítjuk a telepet és 10 ml steril desztillált vízben szuszpendáljuk. A szuszpenzióval négy darab 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilizett 100—100 ml, a következő összetételű vegetatív táptalajt oltunk: Oldódó kukorica-desztillátum"1 " 25,0 g Laktóz 10,0 g Maltóz 10,0 g FeS04 -7H 2 0 0,01 g MgS04 .7H 2 0 2,0 g KH2 P0 4 2,0 g CaC03 2,0 g Desztillált víz 1,1 liter +Nadrisol, National Distillers Products Coi pany, USA. 30 °C hőmérsékleten, 250 percenkénti fordulattal rázódó rázóasztalon 24 órán át tenyésztjük a négy tenyészetet. A vegetatív tenyészet 10—10 ml-ével 15 X100 ml, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett, a következő összetételű fermentációs táptalajt oltunk: Húskivonat 5g Pankreázzal emésztett pepton (kazein) 5g NaCl 5g Glicerin 15 g CaC03 2g Desztillált víz 1 liter A táptalaj pH-ja 7,2, ezt nem változtatjuk. A beoltott tenyészeteket 72 órán át az előzőekben megadott körülmények között tenyésztjük. 40 literes fermentorban a következő összetételű termelő-táptalajt állítjuk elő: Polisziloxán olaj Sg (habzásgátló) Glicerin 375 g Dextróz 625 g Pankreázzal hidrolizált pepton (kazein) 125 g Húskivonat 125 g NaCl 125 g CaCOs 50 g Desztillált víz 24 liter A táptalaj pH-ját 7,0-re állítjuk be. Ezután autoklávban 120 °C hőmérsékleten, 1—1,5 atü nyomáson, 30 percen át sterilezzük a táptalajt. A táptalaj pH-ja sterilezés után 7,6. 100ml etanolban 25 g tisztított monensint oldunk, (jellemzőit lásd a 3. 501. 568 sz. USA-beli szabadalmi leírásban) az oldatot hozzáadjuk a kisterilezett táptalajhoz, majd beoltjuk 700 ml, az előzőekben megadottak szerint előállított inokulum-tenyészettel. 5 A beoltott tenyészeten percenként 1 liter steril levegőt buborékoltatunk át, és általánosan használt keverővel percenként 420-as fordulatszámmal keverjük. A tenyésztést 30 °C hőmérsékleten 114,5 órán át folytatjuk. 10 A fermentáció előrehaladását szilikagélen kivitelezett vékonyrétegkromatográfiával követjük, ahogy azt az előzőekben ismertettük. A kromatogramon fokozatosan megjelenő második folt jelzi az A 27106 metabolit jelenlétét, végül csak az A 27106-lő -ra jellemző folt jelenik meg. 2. példa Az A 27106 elkülönítése és tisztítása 20 Az 1. példában megadott eljárással előállított tenyószlevet szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A micéliumot tartalmazó szűrési maradékot szobahőmérsékleten 5 liter metanollal extraháljuk. Szűrjük a metanolos extraktumot, és a szűr-25 letet a metanol eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor desztillációs maradékként vizes sűrítményt kapunk. A vizes sűrítményt hozzáadjuk az eredeti szűrlethez. A körülbelül 22 liter térfogatú egyesített olda-30 tot kétszer 11 liter kloroformmal extraháljuk. Egyesítjük a kloroformos extraktumokat és a csökkentett nyomáson desztilláljuk. Desztillációs maradékként 400 ml sötét-borostyánkőszínű olajos anyagot kapunk. 35 Kloroformban oldjuk a desztillációs maradékot, az oldatot színtelenítés céljából 10 kg aktív szénből (Pittsburg ,,12x40") készült kromatografáló oszlopra öntjük, a hatóanyagot 5 liter kloroformmal eluáljuk. Csökkentett nyomáson desztilláljuk az 40 eluátumot, amikor desztillációs maradékként 500 ml színtelen-halványsárga színű olajos terméket kapunk. A színtelen olajos anyagot a lehető legkevesebb kloroformban oldjuk, az oldatot 25 kg szilikagélből 45 (Grace, grade 62) és etilacetátból készült kromatografáló oszlopra öntjük. Az eluálást az előzőekben megadottak szerint, vékonyrétegkromatográfiával ellenőrizzük. A szennyezőanyagokat etilacetáttal eluáljuk, majd az eluálást etilacetát és metanol 50 19:1 arányú elegyével folytatjuk és eluáljuk az A 27106 metabolitot. Az A 27106-ot tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor száraz desztillációs maradékként egy amorf, majdnem fehér színű terméket kapunk. Ezt 55 hexánnal mossuk és szárítjuk, amikor 12,84 g A 27106 metabolitot kapunk. A termék a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint egynemű. 60 3. példa Az A 27106 előállítása Streptomyces connamonensisszel és Streptomyces candidusszal. 65 A következőkben egy másik eljárást ismertetünk 6
