167256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein tisztítására
7 167256 8 Az enzimes úton átalakított felülúszóból a lebontott proteineket dialízissel és szűréssel elkülönítve, majd a kapott terméket elektroforézissel vizsgálva megállapítható, hogy a Pronáz és a Pankreatin távolította el a legtöbb protein-jellegű szennyezést, második leghatásosabb enzim a szubtilizin volt, majd a papain és bromelain következik a hatásossági sorrendben. A leggyengébb eredményt a sertés-peptidázzal értük el. A pankreatinnal és bromelainnal történt emésztés után az oldatban maradó protein-jellegi! szennyeződéseket legkönynyebben DEAE-cellulózon végzett ioncserélő kromatográfiával távolíthatjuk el. 2. példa 408 g friss májat 816 ml olyan 7,5 pH-jú 0,025 mólos trisz-pufferben szuszpendálunk, amely 0,3 mól szacharózt szukrózt és 0,05 mól káliumkloridot tartalmaz. A szuszpenziót 1 órán keresztül 13 000 g érték mellett centrifugáljuk; a kapott zavaros felülúszó térfogata 800 ml, pH-ja 6,3. A felülúszó 100 ml-es részleteit (orgotein-tartalom: 15—30 mg a proteinekre számítva 0,25—0,5% 2 napon keresztül 37 °C-on a II. táblázatban feltüntetett proteolitikus enzimekkel emésztjük a táblázatban feltüntetett körülmények között, majd a kapott elegyeket dializáljuk. Az elegyekhez 0,1% nátriumazid konzerválószert adunk. 77. táblázat W Enzim Enzim mennyisége 100 ml májextraktumra vonatkoztatva Í-J ,<° Sfcl 53 ft w" ft a termék orgotein tartalma a. Pronáz 40 mg 8,0, 1 mólos trisz-puffer + 1 ml 0,1 mól Ca++ 5--10° Pankreatin 6g 7,5, 1 mólos trisz-puffer Szubtililizin 8 mg 7,5, 1 mólos trisz-puffer 2,5-5% Papain 3,2 mg 6,2 1,2-2,5% A legjobb eredményt pankreatinnal, Pronázzal és szubtilizinnel értük el. A pankreatinnal kezelt oldatból a maradék proteineket legkönnyebben DEAE-cellulózon végzett ioncserélő kromatográfiával távolíthatjuk el. 3. példa 300 g májat összekeverünk 600 ml olyan 0,025 mólos trisz-puffer 0,025 mólos glicin-puffer elegyével, amelynek pH-ja 7,5 és 0,01 mól Mn++ -iont tartalmaz. A szuszpenziót centrifugáljuk, a maradékot a fenti pufferrel konzerváljuk. A felülúszót 40 5—10% 45 50 55 60 65 térfogata 570 ml proteintartalma 110 mg protein/ ml a proteinekre számított orgotein-tartalma 0,2%. A felülúszó részleteit a III. táblázatban megadott koncentrációjú pankreatinnal vagy pronázzal emésztjük, majd az orgotein és a lebomlott proteinek elkülönítésére az elegyet dializáljuk. 777. táblázat 10 20 25 30 35 1 Enzim Műveleti feltételek 15 M Enzim mennyisége (100 ml extraktumra vonatkoztatva) A termék orgoteintartalma Pronáz 1 38 °C, pH 8,0 mólos triszpufferrel, 0,1 % Na-aziddal, 0,001 mól Ca++ -ionnal 2 mg 0,6% b. Pronáz 38 °C, pH 8,0 1 mólos triszpufferrel, 0,1 % Na-aziddal, 0,001 mól Ca++-ionnal 1% Pankreatin 38 °C, pH 7,5 1 mólos triszpufferrel, 0,1 % Na-aziddal 300 mg 4% Pankreatin 38 °C, pH 7,5 1 mólos trisz- . pufferrel, 0,1 % Na-aziddal 600 mg 4% A pankreatin a vizsgált koncentráció tartományban (3—150 mg/ml) gyakorlatilag azonos hatékonyságú volt. A pronázt 2 mg/ml-ről 0,02 illetve 0,04 mg/ml-re hígítva az enzim hatékonysága csökkent. 4. példa Marhamájat 2 ml puffer/g máj arányban 7,5 pH-jú 0,025 mólos trisz-puffer és 0,025 mólos glicinpuffer elegyében szuszpendálunk; a puffer 0,01 mól Mn++ -iont is tartalmaz. A szuszpenziót 60 percen keresztül 0 °C-on 20 000 G-vel centrifugáljuk. A kapott felülúszó extrahált protein-tartalma 60 g/liter, orgotein-tartalma kb. 150 mg/liter a proteinekre számítva 0,2%, 4XNF aktivitású disznó pankreászból elkülönített pankreatinbol 7,5 pH-jú 0,05 mólos trisz-pufferben 100 mg/ml töménységű törzsoldatot készítünk. A 6,7 pH-jú fenti felülúszó pH-ját 1 mólos trisz-pufferrel 7,5-re állítjuk be, majd — 10 ml extraktumra vonatkoztatva — 6 ml (0,6 g) pankreatin törzsoldatot és 1 ml 10%-os nátriumazid-oldatot adunk az elegyhez. A 7,5 pH-jú elegyet 2 napon keresztül 37 °C-on inkubáljuk; ezalatt az elegy színe vörösről barnára változik. A kezelés után az elegy proteintartalma kb. 3 g/liter, orgotein-tartalma kb. 150 mg/ml. 4
