167256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein tisztítására

3 167256 4 Meglepő módon azt találtuk ugyanis, hogy az orgotein ellenáll a proteolitikus enzimek lebontó hatásának. Ennek következtében tetszés szerinti proteolitikus enzimet alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárásban: nyers és tisztított exopeptidázokat és endopeptizádokat továbbá ezek keverékeit. Ilyen enzimekre az alábbi példákat említjük meg: leucin-aminopeptidázok és más aminopeptidázok, karboxipeptidáz A és karboxipeptidáz B féleségek, pepszin, tripszin, a-kimotripszin, kimotripszin B, prolinál, prolidáz, katepszinek, leucilpeptidáz, dipeptidáz, papain, bromelain, ficin, aszklepain, mexikain, pomiferain, plazmin, tetahiema proteináz, Bac. substilis proteináz, Pseud. aeruginosa proteináz, Streptococcus proteináz, Streptomyces griseus proteináz, így pronáz, stb. továbbá durván tisztított szövetextraktumok, így Pankreatin, lép- vagy vese proteolitikus enzimextraktumai. A találmány szerinti eljárásban a fenti enzimek közül előnyösen Strept. griseus proteinázt, pankreatint, subtilisint, papaint vagy bromelaint alkalmazunk. Ezek közül különösen a pankreatin alkalmas nagymennyiségű protein-jellegű szennyeződés eltávolítására. A tisztított proteinázok, például a „Pronáz" (gyártja és forgalomba hozza a Kand. K. Laboratories cég, Hollywood, Kalifornia, USA.) segítségével a tisztított orgoteinből a kismennyiségű maradók proteint távolíthatjuk el előnyösen. A proteolitikus enzimek maguk is protein-jellegű anyagok, s így kezdetben a protein-jellegű szennyeződésekhez kapcsolódnak. Az enzimek azonban általában saját magukat is lebontják, s így könnyen elkülöníthetők az orgoteintől. Az elkülönítés például dialízissel történhet vagy a termékek különböző töltésén vagy molekulaméretén alapulhat. A proteinek lebontására az enzimeket általában a proteinekre vonatkoztatva egynél kisebb súlyarányban alkalmazzuk [Chance: Adván. Enzymol., 12, 153, 171 (1951)]. A proteinkeverékbe adagolt proteolitikus hatású enzimek hatása tehát végeredményképpen az, hogy ezek az enzimek a felesleges proteineket kismolekulasúlyú termékekre bontják, az orgoteint pedig változatlanul hagyják. A protein jellegű szennyeződések enzimhez történő kapcsolódását például inszolubilizált enzimek felhasználásával akadályozhatjuk meg. Erre a célra például oldhatatlan hordozóanyaghoz kapcsolt pankreatint vagy proteinázt alkalmazhatunk [Emery, A. N. Kent, C. A., Birmingham Univ. Chem. Eng., 21, 71—76 (1970)]. A találmány szerinti eljárást orgoteint tetszés szerinti mennyiségben tartalmazó vízoldható proteinkeverékekre alkalmazhatjuk, így olyan keverékekre, amelyek 5%-nál kevesebb, előnyösen 1%-nál kevesebb orgoteint tartalmaznak. Ilyen keverékek például az orgotein-forrásból extrakcióval előállított nyers keverékek, durván tisztított — 5—50% orgoteint tartalmazó elegyek, és a főképpen orgoteint tartalmazó tisztított elegyek tehát azok a keverékek, amelyek orgotein-tartalma 90%-nál nagyobb. Az orgoteint például az alábbi sejtekből és szövetekből extrahálhatjuk: vörösvérsejtek, máj, harántcsíkolt izomszövet, vese, szívizom, tüdőszövet, bélszövet. A találmány szerinti eljárás tehát orgotein elkülönítésére szolgáló eljárások részeként is alkalmazható továbbá már elkülönített, orgoteinből nyomnyi mennyiségű protein-jellegű szennyezés elkülö-5 nítésére is használható. A találmány előnyösen használható májból, pontosan marhamájból extrahált orgotein-tartalmú vízoldható proteinkeverékben levő orgotein tisztítására és elkülönítésére. A találmány egy másik 10 előnyös foganatosítási módja szerint az orgoteint orgoteinben dúsított proteinkeverékből különítjük el. így vérből vagy szövetextraktumbói, például májból vagy eritrocitákból, amelyeket a hőre bomló proteinek elbontására előzetesen hővel kezelünk, 15 különítjük el az orgoteint. A találmány előnyös foganatosítási módja szerint az enzimes kezeléssel az elegy proteintartalmának nagy részét, célszerűen legalább 80%-át elbontjuk. A kezelt elegy igen kismennyiségű orgo-20 teint, például 5%-nál kevesebb, előnyösen 0,01— 1% orgoteint tartalmaz. Ilyen keverékek például a vörösvérsejtekből, veséből és májból, előnyösen marhamájból extrahált teljesen oldható proteinkeverékek. 25 A találmány szerinti eljárás különös előnye, hogy az eljárással kezelt protein-keverékek sokkal eredményesebben választhatók szót kromatográfiás úton. Előfrakcionálás nélkül csupán mintegy 4 grammekvivalens oldható májproteint lehet kro-30 matografálni 1 ml DEAE cellulózon. A találmány szerinti előzetes lebontás révén ez a mennyiség legalább 5—10-szeresére növelhető. Különösen előnyösnek találtuk az eljárást a protein-keverék mintegy 60—80 C°-os előzetes hőkeze-35 lése után. Ily módon az oldatban maradó proteinek keverékét dolgozzuk fel. Az orgoteint tartalmazó kiindulási protein-keveréket a kiválasztott proteolitikus enzim lebontó hatásának tesszük ki. Az enzimes kezelést a kivá-40 lasztott enzimnek megfelelő protein-enzim aránynyal, a kiválasztott enzimnek megfelelő pH-n és hőmérsékleten végezzük az enzimtől függően megválasztott idő alatt. A kiindulási protein-keveréket vízben oldjuk. Az 45 orgotein vízben oldható és stabil. Célszerűen úgy járunk el, hogy az oldáshoz egy 1 és 13 közötti előnyösen 4 és 10 közötti pH-jú, célszerűen 5—6 vagy 7,5 körüli pH-jú és 0,1 mólnál kisebb ionerősségű puffert használunk, amely egy vagy több 0,65— 50 1,00 Á ionátmérőjű kétvegyértékű fémion, például kobalt, réz, vas, germánium, magnézium, nikkel, cink, mangán vagy kalcium kis mennyiségét tartalmazza. Az orgoteint tartalmazó kiindulási protein-55 keverékből tetszés szerinti koncentrációjú, így például 0,01—10%-os vagy ennél töményebb vizes oldatot készíthetünk. Az oldat ionerőssége előnyösen 0,001—0,1 mól, mely értéket egy sóval, például nátriumkloriddal, vagy egy pufferrel, például 60 trisz-pufferrel, glicin-pufferrel vagy foszfát-pufferrel biztosíthatunk. Az oldat célszerűen egy vagy több 0,65—1,00 Á ionátmérőjű kétvegyértékű fémiont, így magnéziumot, rezet, cinket és/vagy mangánt tartalmaz. 65 Az enzimatikus lebontást 0—60 °C, előnyösen 2